噬菌体裂解法检测结核杆菌对链霉素敏感性的研究
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【关键词】 噬菌体；结核杆菌；链霉素；敏感性
1993年世界卫生组织宣布结核病疫情处于紧急状态，近年来一直呈现出上升趋势。自Koch发现结核菌以来，人类对于结核病的发病机理、化学疗法诊断的研究不断取得新进展，然而迄今为止仍有许多重要问题有待解决。在实验室诊断方面，传统诊断方法存在严重的缺点和不足，一些新方法有待去探索、研究。结核菌培养+药敏试验结果报告时间长，需要2～3个月，无法为临床提供及时的用药参考，需要研究新的实验室诊断方法[1]。
1947年Gardner首先分离并命名分支杆菌噬菌体，对分支杆菌具有特异性，其做为工具被应用于结核杆菌的研究。在国外以分支杆菌噬菌体为基础的结核分支杆菌的分类学、结核杆菌分子生物学、结核病诊断耐药性分析和新药筛选等已成为研究热点[2]。本文利用结核分支杆菌噬菌体裂解法进行结核杆菌对链霉素敏感性的临床应用研究。
, http://www.100md.com 1 材料与方法
1.1 材料 实验用菌株均由我所临床提供，69例标本，其中链霉素敏感株37例，链霉素耐药株32例。
1.2 试剂 英国BIOTEC公司生产的结核杆菌检测试剂盒(FAST Plaque TBTM)。
1.3 方法 ①用FPTB培养介质配制菌液，终浓度2×10-3mg/ml，加入链霉素药液，终浓度分别为1、2、4 μg/μl，对照管1只(不加异烟肼)，37℃孵育24 h;②感染噬菌体：向标本中加100 μl噬菌体(Actiphage),37℃孵育1 h；③杀死TB体外游离的噬菌体：向标本中加100 μl强效病毒(Virusol)，充分震荡，静置5 min；④中和：向标本中加5 ml Medium plus，片刻静置；⑤表达：向标本中加1 ml帮助细胞(Helper cell),倒入平板中，加入5 ml融化的琼脂胶，迅速旋转混匀，静置37℃过夜。
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1.4 结果判定 以异烟肼作用管菌斑数/无药对照管菌斑数≥临界值为耐药，反之为敏感。本文以5%、10%、20%为临界值分别探讨。
2 结果
以不同药物浓度、不同判定界值检测异烟肼的敏感性的检测结果，见表1、2、3。
当以异烟肼作用管菌斑数/无药对照管菌斑数≥5%为临界值，异烟肼药物浓度分别为1、2、4 μg/ml时，其灵敏度分别为96.3%、92.6%、74.1%，特异度为68.0%、76.0%、96.0%，与传统方法的符合率分别为82.7%、84.6%、84.6%。
当以异烟肼作用管菌斑数/无药对照管菌斑数≥10%为临界值，异烟肼药物浓度分别为1、2、4 μg/ml时，其灵敏度分别为96.3%、88.8%、66.6%，特异度为80.0%、88.0%、100.0%，与传统方法的符合率分别为88.5%、88.5%、82.7%。
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当以异烟肼作用管菌斑数/无药对照管菌斑数≥20%为临界值，异烟肼药物浓度分别为1、2、4 μg/ml时，其灵敏度分别为81.5%、74.0%、59.3%，特异度为92.0%、96.0%、96.0%，与传统方法的符合率分别为86.5%、82.7%、76.9%。
根据以上的实验得出异烟肼药物管噬菌斑数/对照管噬菌斑数≥10%作为耐药的判定点、药物浓度为2 μg/ml较为合适。
3 讨论
世界性结核病回升的主要原因之一，即是耐药结核患者的逐年增加，尤其是耐多药结核病(MDR-TB)患者[3]。及时并快速地检测结核患者的药物敏感性，尤其是作为抗结核一线药物中的异烟肼，成为结核病治疗中的关键环节。
本方法是利用裂解性噬菌体在宿主中进行子代增殖，裂解周围宿主产生噬菌斑，由于噬菌斑数量与活宿主菌数呈正相关，根据此原理进行结核菌药物敏感性实验。异烟肼通过影响结核菌的新细胞壁合成而起到杀菌作用，起效慢，结核菌还具有较强的自我修复能力。据此，我们采用异烟肼药物作用48 h，本方法得出的数据，通过其敏感度和特异度来衡量，我们认为该方法的结果判定为：异烟肼药物管噬菌斑数/对照管噬菌斑数≥10%作为耐药的判定点，药物浓度为2 μg/ml较为合适，这与一些国内报道基本相符[4]。该方法检测结核菌对异烟肼的耐药性与传统方法比较，其敏感度为88.8%，特异度为88.0%，符合率为88.5%。并在以下方面具有较大优越性：①时间大大缩短，72 h内可以得出结果；②操作简单，无需特殊仪器，经济实用；③便于临床推广。
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实验过程中应注意：①该方法适合检测的细菌为结核分支杆菌、牛分支杆菌、非洲分支杆菌，且均为活菌；②实验过程设阴性对照；③严格进行无菌操作，避免污染。加入杀毒剂要彻底混匀；④向平板中加琼脂温度不易过高50℃～60℃，防止噬菌体灭活。
参考文献
1 王苏民.结核病及其实验技术的现状与展望.中华检验医学杂志，2001，24(2)：71-72.
2 McNerney R.TB：the return of the phage.Areview of fifty years of mycobacterphage.Int J Tuberc Lung Dis，1999,3:179-184.
3 唐神结，肖和平.分支杆菌快速分离培养技术研究进展.中华结核和呼吸杂志，2000,23:762-764.
4 彭丽，称保文.噬菌体生物扩增法与改良罗氏比例法在结核杆菌药敏检测中的比较.中国防痨杂志，2005，27：18-22., 百拇医药(李玉华)