蒙药娜仁满都拉-11抑制胃肿瘤增殖及其机制的实验研究(2)
1.3.1 蒙药娜仁满都拉-11由内蒙古中蒙医院制剂室提供。
1.3.2 氟脲嘧啶片(5-FU)山西鑫煜制药有限公司生产 购自附属医院药房。
1.4 主要试剂与仪器。
1.4.1 免疫组化SP试剂盒 购自福洲迈新试剂公司。
1.4.2 CyclinD1 兔抗鼠抗体购自武汉博士德试剂公司。
1.4.3 PI染料 Sigma公司生产。
1.4.4 流式细胞仪 Epics-XLⅡ型，美国Beckman Coulter。
2 实验方法
2.1 模型的建立与实验分组 将冻存的Walker-256腹水复苏呈液态,在清洁条件下注入Wistar大白鼠腹腔内。1周后将形成的腹水模型鼠腹水与生理盐水按1∶1混合后，注射在 Wistar大白鼠后肢皮下，7~10 d即可形成皮下实体瘤，将其剥取，剪成约0.5 mm×0.1 mm大小的组织碎片,在10 g/L异戊巴比妥钠(4 ml/kg)腹腔麻醉下，塞入Wistar大白鼠胃壁浆肌层隧道内,第8天按原切口进入腹腔，可见鼠胃种植区形成大小不等的肿瘤。将成功的胃肿瘤模型鼠随机分为3组(每组8只)：670 mg/(kg•d)(蒙药治疗组)，等体积生理盐水(阴性对照组)，5-FU 20 mg/(kg•d)(阳性对照组)。从胃肿瘤模型成功次日开始，灌胃1次/d，连续10 d。
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2.2 观察指标
2.2.1 光学显微镜下观察种植性胃肿瘤的瘤细胞与腹水、种植性实体瘤细胞同源。瘤细胞形状不规则，胞核大而深染，胞核呈多形性，瘤细胞增生活跃，细胞排列紊乱，保持了原有的瘤细胞的特点。
2.2.2 抑瘤率
给药第11天(即末次给药后第2天),处死大鼠,剥离瘤体后称重(W),计算抑瘤率(I)，I=(对照组W-治疗组W)/对照组W×100%。
2.2.3 免疫组化检测 免疫组化染色:免疫组化检测采用SP法。每批实验用已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断：CyclinD1为胞核着色，标本胞核内出现棕黄或棕黑色颗粒，且强度高于本底为阳性细胞。阳性细胞表达强度可用它们的光密度来表示，并使用JD801图象分析软件分析表达强弱情况。
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2.2.4 流式细胞术检测 首先将固定在70%乙醇中的肿瘤组织制备成单细胞悬液。PI染色：取1 ml悬液(1×105个细胞)，加入碘化丙啶(PI)(PI：50 mg/L,0.5%triton-x100,10 μg/ml RNaseA,2.5 mmol/L柠檬酸钠)1 ml,在4℃染色30 min，3 h内即可上机检测。
2.3 数据统计 实验数据以SPSS11.0统计软件对实验数据进行统计分析，用均值±标准差表示。多个样本均数比较选用单因素方差分析(One-way ANOVA0)、两两比较选用最小显著差法(Leastsignificantdifference，LSD)；P
3.2 免疫组化结果 表2示5-FU组、蒙药治疗组的CyclinD1表达水平均较生理盐水组减少，即胞核棕染的阳性细胞较生理盐水组减少且差异有统计学意义(P0.05)。
3.3 流式细胞仪检测细胞周期分布结果
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表3显示与生理盐水组比较5-FU组、蒙药治疗组肿瘤细胞在S期的比例下降而G0/G1期的比例增高,差异有统计学意义(P0.05)。
4 讨论
真核细胞的分裂周期遵循G1期→S期→G2期→M期的演变规律。在这个演变过程中存在多个限制点，其中G1→S和G2→M为两个重要的限制点，调节各时相的切换及细胞周期进程,而前者尤为重要。G1→S期限制点决定着细胞是继续增殖还是进入G0期,或永久离开细胞周期进入终末分化死亡。本研究显示娜仁满都拉-11治疗组和5-FU组，肿瘤细胞处于G0、G1期的比例高于生理盐水组,处于S期细胞的比例低于生理盐水组(P0、G1期,而不进入S期进行DNA复制,从而起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
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CyclinD1基因定位于染色体llq13，编码的蛋白由295个氨基酸组成，后者在G1→S期转换中发挥着重要的正性调控作用，其表达失控有可能引起细胞异常增殖而发生肿瘤。目前已发现CyclinD1在人类许多肿瘤[6-10]中存在过表达现象。是已被证实的与肿瘤有直接关系的癌基因。本实验采用免疫组化方法检测鼠种植性胃肿瘤CyclinD1表达结果显示,娜仁满都拉-11治疗组肿瘤细胞CyclinD1表达强度均低于生理盐水组(P0.05)，表明娜仁满都拉-11和5-FU有一定的下调CyclinD1表达的效应，从而抑制肿瘤细胞增殖。
综上所述，娜仁满都拉-11对Walker-256大鼠胃种植性肿瘤有一定的抑制作用，这与前期研究数据相接近。该蒙药抗肿瘤机制可能是以CyclinD1为作用靶点，即通过抑制细胞CyclinD1蛋白表达，影响细胞周期G1/S调控点，阻止肿瘤细胞由G1期向S期转变，使细胞停留在G0/G1期，从而对肿瘤细胞起抑制作用。因此，本研究为该蒙药的进一步筛选，开发利用及选择最适剂量提供了理论与实验依据，同时为抗癌蒙药临床应用探索一条可能的途径。
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参考文献
1 孙斌，瞿伟箐，张晓玲,等.蒺藜皂苷对人肝癌细胞BEL-7402生长抑制和诱导凋亡作用的研究.中国中药杂志，2004，29(7)：681-684.
2 张曙，胡梅洁.天花粉蛋白诱导的胃癌细胞凋亡与bcl-2表达下降有关.中华消化杂志，2000，20(6)：380.
3 涂水平，江石湖.天花粉蛋白诱导胃癌细胞MKN-45凋亡的研究.癌症，2000，19(12)：1105.
4 潘兴瑜，张明策，李宏伟,等.玉竹提取物B对肿瘤的抑制作用.中国免疫学杂志，2000，16(7)：376-377.
5 邓秀玲,刘淑萍,陈莉.蒙药升阳十一味丸对胃癌细胞抑制作用及其机制的研究.实用肿瘤学杂志,2005,19(5)：365-367.
, http://www.100md.com
6 吴继锋，邵晋晨，王道斌，等.细胞周期调控因子在胃癌组织中的表达及意义.癌症，2005，24(2)：175-179.
7 Walczak PG，Kordek R，Faflik M.P21(WAF1)expression in colorectal cancer：correlation with P53 and cyclinD1expression，clinicopathological parameters and prognosis.Pathol Res Pract，2001,197(10)：683-689.
8 王华新，唐建武，周春辉，等.cyclinD1，CDK4在肺癌中的表达.临床与实验病理学杂志，2003,19(3)：326-327.
9 江捍平，王大平，肖建德，等.骨软骨瘤和骨恶性肿瘤cyclinD1和CDK4的表达及意义.中国现代医学杂志，2004,14(11)：31-34.
10 马红兵，王作仁，狄政莉，等.胆囊癌组织p16和CyclinD1表达.第四军医大学学报，2003,24(18)：1665-1667., 百拇医药(乌云高娃 刘淑萍 王海生 陶 慧)
1.3.2 氟脲嘧啶片(5-FU)山西鑫煜制药有限公司生产 购自附属医院药房。
1.4 主要试剂与仪器。
1.4.1 免疫组化SP试剂盒 购自福洲迈新试剂公司。
1.4.2 CyclinD1 兔抗鼠抗体购自武汉博士德试剂公司。
1.4.3 PI染料 Sigma公司生产。
1.4.4 流式细胞仪 Epics-XLⅡ型，美国Beckman Coulter。
2 实验方法
2.1 模型的建立与实验分组 将冻存的Walker-256腹水复苏呈液态,在清洁条件下注入Wistar大白鼠腹腔内。1周后将形成的腹水模型鼠腹水与生理盐水按1∶1混合后，注射在 Wistar大白鼠后肢皮下，7~10 d即可形成皮下实体瘤，将其剥取，剪成约0.5 mm×0.1 mm大小的组织碎片,在10 g/L异戊巴比妥钠(4 ml/kg)腹腔麻醉下，塞入Wistar大白鼠胃壁浆肌层隧道内,第8天按原切口进入腹腔，可见鼠胃种植区形成大小不等的肿瘤。将成功的胃肿瘤模型鼠随机分为3组(每组8只)：670 mg/(kg•d)(蒙药治疗组)，等体积生理盐水(阴性对照组)，5-FU 20 mg/(kg•d)(阳性对照组)。从胃肿瘤模型成功次日开始，灌胃1次/d，连续10 d。
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2.2 观察指标
2.2.1 光学显微镜下观察种植性胃肿瘤的瘤细胞与腹水、种植性实体瘤细胞同源。瘤细胞形状不规则，胞核大而深染，胞核呈多形性，瘤细胞增生活跃，细胞排列紊乱，保持了原有的瘤细胞的特点。
2.2.2 抑瘤率
给药第11天(即末次给药后第2天),处死大鼠,剥离瘤体后称重(W),计算抑瘤率(I)，I=(对照组W-治疗组W)/对照组W×100%。
2.2.3 免疫组化检测 免疫组化染色:免疫组化检测采用SP法。每批实验用已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断：CyclinD1为胞核着色，标本胞核内出现棕黄或棕黑色颗粒，且强度高于本底为阳性细胞。阳性细胞表达强度可用它们的光密度来表示，并使用JD801图象分析软件分析表达强弱情况。
, 百拇医药
2.2.4 流式细胞术检测 首先将固定在70%乙醇中的肿瘤组织制备成单细胞悬液。PI染色：取1 ml悬液(1×105个细胞)，加入碘化丙啶(PI)(PI：50 mg/L,0.5%triton-x100,10 μg/ml RNaseA,2.5 mmol/L柠檬酸钠)1 ml,在4℃染色30 min，3 h内即可上机检测。
2.3 数据统计 实验数据以SPSS11.0统计软件对实验数据进行统计分析，用均值±标准差表示。多个样本均数比较选用单因素方差分析(One-way ANOVA0)、两两比较选用最小显著差法(Leastsignificantdifference，LSD)；P
3.2 免疫组化结果 表2示5-FU组、蒙药治疗组的CyclinD1表达水平均较生理盐水组减少，即胞核棕染的阳性细胞较生理盐水组减少且差异有统计学意义(P0.05)。
3.3 流式细胞仪检测细胞周期分布结果
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表3显示与生理盐水组比较5-FU组、蒙药治疗组肿瘤细胞在S期的比例下降而G0/G1期的比例增高,差异有统计学意义(P0.05)。
4 讨论
真核细胞的分裂周期遵循G1期→S期→G2期→M期的演变规律。在这个演变过程中存在多个限制点，其中G1→S和G2→M为两个重要的限制点，调节各时相的切换及细胞周期进程,而前者尤为重要。G1→S期限制点决定着细胞是继续增殖还是进入G0期,或永久离开细胞周期进入终末分化死亡。本研究显示娜仁满都拉-11治疗组和5-FU组，肿瘤细胞处于G0、G1期的比例高于生理盐水组,处于S期细胞的比例低于生理盐水组(P0、G1期,而不进入S期进行DNA复制,从而起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
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CyclinD1基因定位于染色体llq13，编码的蛋白由295个氨基酸组成，后者在G1→S期转换中发挥着重要的正性调控作用，其表达失控有可能引起细胞异常增殖而发生肿瘤。目前已发现CyclinD1在人类许多肿瘤[6-10]中存在过表达现象。是已被证实的与肿瘤有直接关系的癌基因。本实验采用免疫组化方法检测鼠种植性胃肿瘤CyclinD1表达结果显示,娜仁满都拉-11治疗组肿瘤细胞CyclinD1表达强度均低于生理盐水组(P0.05)，表明娜仁满都拉-11和5-FU有一定的下调CyclinD1表达的效应，从而抑制肿瘤细胞增殖。
综上所述，娜仁满都拉-11对Walker-256大鼠胃种植性肿瘤有一定的抑制作用，这与前期研究数据相接近。该蒙药抗肿瘤机制可能是以CyclinD1为作用靶点，即通过抑制细胞CyclinD1蛋白表达，影响细胞周期G1/S调控点，阻止肿瘤细胞由G1期向S期转变，使细胞停留在G0/G1期，从而对肿瘤细胞起抑制作用。因此，本研究为该蒙药的进一步筛选，开发利用及选择最适剂量提供了理论与实验依据，同时为抗癌蒙药临床应用探索一条可能的途径。
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参考文献
1 孙斌，瞿伟箐，张晓玲,等.蒺藜皂苷对人肝癌细胞BEL-7402生长抑制和诱导凋亡作用的研究.中国中药杂志，2004，29(7)：681-684.
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3 涂水平，江石湖.天花粉蛋白诱导胃癌细胞MKN-45凋亡的研究.癌症，2000，19(12)：1105.
4 潘兴瑜，张明策，李宏伟,等.玉竹提取物B对肿瘤的抑制作用.中国免疫学杂志，2000，16(7)：376-377.
5 邓秀玲,刘淑萍,陈莉.蒙药升阳十一味丸对胃癌细胞抑制作用及其机制的研究.实用肿瘤学杂志,2005,19(5)：365-367.
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7 Walczak PG，Kordek R，Faflik M.P21(WAF1)expression in colorectal cancer：correlation with P53 and cyclinD1expression，clinicopathological parameters and prognosis.Pathol Res Pract，2001,197(10)：683-689.
8 王华新，唐建武，周春辉，等.cyclinD1，CDK4在肺癌中的表达.临床与实验病理学杂志，2003,19(3)：326-327.
9 江捍平，王大平，肖建德，等.骨软骨瘤和骨恶性肿瘤cyclinD1和CDK4的表达及意义.中国现代医学杂志，2004,14(11)：31-34.
10 马红兵，王作仁，狄政莉，等.胆囊癌组织p16和CyclinD1表达.第四军医大学学报，2003,24(18)：1665-1667., 百拇医药(乌云高娃 刘淑萍 王海生 陶 慧)