凝血酶敏感蛋白-1对胆囊癌细胞凋亡的实验研究(1)
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【摘要】 目的 研究凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)对胆囊癌细胞GBC-SD凋亡的体外诱导作用及其可能的作用机制。方法 采用流式细胞术检测TSP-1及其受体CD36，CD47作用后HCCLM3的凋亡率，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Caspase-3 mRNA表达的变化。结果 TSP-1组凋亡率(10.56±0.63)%显著高于对照组(3.17±0.33)%和CD47阻断组(4.05±0.27)%(P[1]。胆囊癌的发生、发展的各步骤是在多种细胞因子共同作用下发生的。凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)是一种多功能糖蛋白，可调节肿瘤细胞的生长、粘附、迁移等生物学行为[2]。但对胆囊癌细胞作用的研究尚未见报道，本文通过体外细胞培养的方式，研究TSP-1对胆囊癌细胞株GBC-SD凋亡的作用及其发挥作用的可能途径。
1 材料与方法
1.1 材料 TSP-1蛋白，CD47单抗，CD36单抗购于Sigma公司，胆囊癌细胞系 GBC-SD购于复旦大学肝癌研究所，总RNA分离试剂盒(Gibco公司)， AMV为TaKaRa公司产品，dNTP购自上海生工生物工程公司,引物由上海生工生物公司合成，TagTMDNA聚合酶为TaKaRa产品。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 胆囊癌细胞GBC-SD在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液(含双抗)，37℃含5%CO2孵箱培养，对数生长期细胞为实验对象。
1.2.2 分组 按照处理因素把GBC-SD分为4组，实验组(加入TSP-1蛋白40 g/ml)、CD36阻断组和CD47阻断组(浓度为5 g/ ml单抗孵育30 min后加入TSP-1蛋白)、对照组，培养72 h。
1.2.3 流式细胞术检测GBC-SD细胞凋亡率 收获各组细胞后，70%冷乙醇固定，1 mg/ml RNase A 10 μl于37℃水浴30 min，100 g/ml碘化丙锭(PI) 50 μl,4℃避光20 min， 调整细胞浓度为1×106/ml，上机检测，CellQuest软件分析凋亡细胞数。
1.2.4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) Trizol一步法提取组织总RNA，逆转录合成cDNA，配成50 L反应体系行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性2 min，95℃变性2 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸10 min，产物于1.2%的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭紫外灯下观察拍照。
1.3 统计学处理 数据采用SPSS11.5数据包统计处理，各计量资料均用均数±标准差表示(x±s)，多组之间的比较采用多样本均数的单因素方差分析。
2 结果
2.1 流式细胞术检测细胞凋亡的结果 TSP-1组(10.56±0.63)%显著高于对照组(3.17±0.33)%, (P0.05)。CD36阻断组(8.49±0.37)%与对照组和TSP-1组比较均差异有统计学意义(P<0.01)，对TSP-1的阻断作用低于CD47抗体阻断组。TSP-1组凋亡率显著高于对照组和CD47阻断组，(P<0.01)。, http://www.100md.com(薛建锋 范正军 赵守魁 王艳瑛 郭广成 刘怀然)