辛伐他汀通过抑制Smad7表达的肾保护作用机制探讨(1)
【摘要】 目的 研究阿霉素肾病大鼠肾小管Smad7表达改变与细胞凋亡的关系，并探讨辛伐他汀通过影响Smad7表达和细胞凋亡的肾保护作用机制。方法 建立大鼠阿霉素肾病模型，RT-PCR半定量分析肾皮质中Smad7 mRNA的表达水平，免疫组化分析Smad7蛋白的定位和表达，用TUNEL法分析细胞凋亡。结果 肾病组肾小管中Smad7 mRNA、蛋白的表达均上调，与肾小管上皮细胞凋亡呈正相关。辛伐他汀可抑制Smad7表达上调、减少肾小管上皮细胞凋亡。结论 阿霉素肾病大鼠肾小管Smad7表达增加与肾小管上皮细胞凋亡相关。辛伐他汀可以通过抑制Smad7表达而降低肾小管上皮细胞凋亡而实现肾保护作用。
【关键词】阿霉素肾病；Smad7；细胞凋亡；辛伐他汀
Study of the renal protect mechanism of simvastatin through effect the expression of Smad7
YOU Yan-wu,LIN Xu,WANG Jie,et al.Dept.Nephrology in Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities,Baise 53300,Guangxi China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression ofSmad7 and apoptosis in the renal tubular of rats with adriamycin nephropathy and study the renal protect mechanism of simvastatin through effect the expression of Smad7 and apoptosis.Methods Animals were randomly assigned to three groups:normal control,adriamycin nephrosis(ADN),and ADN treated with simvastatin(10 mg/kg•d).Expression of Smad7 was evaluated by RT-PCR and immunohistochemistry.Apoptosis was detected by TUNEL method.Results Expression of Smad7 mRNA and protein in ADN rats was significantly upregulated,which showed a positive correlation with tubular cell apoptosis.Simvastatin decreased the level of Smad7.Conclusion The increased expression of Smad7 correlates with tubular cell apoptosis of rats with adriamycin nephropathy.Simvastatin may prevents renal damage through the down-regulation of Smad7 and the reduction of apoptosis.
【Key words】Adriamycin nephropathy;Smad7;Apoptosis;Simvastatin
近来证实他汀类药物在多种肾小球疾病中具有肾脏保护作用，目前认为他汀的有效作用除对胆固醇合成的竞争性抑制外，还在细胞内信号传导途径中执行另外的作用，但是对于他汀类药物在肾小球疾病中的相关作用机制了解不多。研究证实Smads蛋白是转化生长因子-β(transforming growth Factor-β,TGF-β)细胞内信号传导蛋白，其中抑制型Smad-Smad7具有促凋亡作用。然而，Smad7在进行性肾损害时的表达变化以及其与肾组织细胞凋亡关系的研究较少。本研究旨在建立大鼠阿霉素肾病模型，评估肾皮质Smad7的表达水平与细胞凋亡的关系，并探讨辛伐他汀通过影响Smad7表达和细胞凋亡的肾脏保护作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物模型 清洁级SD雄性大鼠36只，体质量180~200 g，自由进食、饮水，适应1周后，随机分为3组,12只/组：第1组为阿霉素肾病组，尾静脉一次性注射阿霉素(法玛西亚公司产品)7.5 mg/kg; 第2组为辛伐他汀治疗组，同第1组处理后第2天起予辛伐他汀10 mg/(kg•d)灌胃；第3组为正常对照组。第4、8周后，收集24 h尿液，测定尿蛋白排泄量，经心脏取血送全自动血生化分析仪测血清肌酐、尿素氮，称肾重，取肾皮质按下述处理。
1.2 光镜检查 取标本置10%甲醛中固定后制成石蜡切片，行常规HE、PAS染色后于光学显微镜下观察肾脏病理形态学改变。
1.3 RT-PCR 取液氮保存的肾皮质，按TRIzol reagent(Life Technologies公司产品)方法提取总RNA，用MMLV逆转录酶(Promega产品)逆转录为cDNA,于PCRprint扩增仪上扩增。引物由北京赛百盛公司合成，Smad7引物序列：正义5′-GGA GTC CTT TCC TCT CTC-3′,反义5′-GGC TCA ATG AGC ATG CTC AC-3′。以GAPDH为内参照：正义5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′,反义5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′。PCR反应为94℃ 45 s,50℃ 45 s,72℃ 45 s,共30个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，用德国VL凝胶成像及分析系统进行摄像并半定量分析，Smad7产物为130 bp，GAPDH产物为309 bp，以对GAPDH相对值记录结果。
1.4 免疫组化 石蜡切片用SP免疫组化法(SP免疫组化试剂盒购自北京中山公司)测定Smad7蛋白的定位和表达，多克隆兔抗鼠Smad7购自Santa Cruz公司，工作浓度1：50。用同济千屏影像工程公司HPIAS2000型图像分析软件行图像分析，高倍镜下每张切片随机选取5个视野分析肾小管阳性区域的灰度值。
1.5 TUNEL法测定细胞凋亡 按TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司产品)方法测定各组肾皮质的凋亡细胞，光镜下每张切片至少随机选取5个视野计数肾小管上皮细胞凋亡细胞数，记录阳性率。
1.6 统计学方法 实验数据以(x±s)表示，用SPSS11.0统计软件对各组同期的Smad7 mRNA、蛋白水平进行组间方差分析，将Smad7 mRNA、蛋白的表达水平分别与凋亡阳性细胞率作双变量相关分析，P<0.05，表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠生化指标 肾病组尿蛋白排泄明显高于正常对照组，而治疗组尿蛋白低于肾病组(P<0.05)。各组血清肌酐、尿素氮值无明显差异。肾病组肾重/体质量值明显高于治疗组及对照组(P<0.05)。见表1。, http://www.100md.com(尤燕舞 林 栩 王 洁 郭鹏威)
【关键词】阿霉素肾病；Smad7；细胞凋亡；辛伐他汀
Study of the renal protect mechanism of simvastatin through effect the expression of Smad7
YOU Yan-wu,LIN Xu,WANG Jie,et al.Dept.Nephrology in Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities,Baise 53300,Guangxi China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression ofSmad7 and apoptosis in the renal tubular of rats with adriamycin nephropathy and study the renal protect mechanism of simvastatin through effect the expression of Smad7 and apoptosis.Methods Animals were randomly assigned to three groups:normal control,adriamycin nephrosis(ADN),and ADN treated with simvastatin(10 mg/kg•d).Expression of Smad7 was evaluated by RT-PCR and immunohistochemistry.Apoptosis was detected by TUNEL method.Results Expression of Smad7 mRNA and protein in ADN rats was significantly upregulated,which showed a positive correlation with tubular cell apoptosis.Simvastatin decreased the level of Smad7.Conclusion The increased expression of Smad7 correlates with tubular cell apoptosis of rats with adriamycin nephropathy.Simvastatin may prevents renal damage through the down-regulation of Smad7 and the reduction of apoptosis.
【Key words】Adriamycin nephropathy;Smad7;Apoptosis;Simvastatin
近来证实他汀类药物在多种肾小球疾病中具有肾脏保护作用，目前认为他汀的有效作用除对胆固醇合成的竞争性抑制外，还在细胞内信号传导途径中执行另外的作用，但是对于他汀类药物在肾小球疾病中的相关作用机制了解不多。研究证实Smads蛋白是转化生长因子-β(transforming growth Factor-β,TGF-β)细胞内信号传导蛋白，其中抑制型Smad-Smad7具有促凋亡作用。然而，Smad7在进行性肾损害时的表达变化以及其与肾组织细胞凋亡关系的研究较少。本研究旨在建立大鼠阿霉素肾病模型，评估肾皮质Smad7的表达水平与细胞凋亡的关系，并探讨辛伐他汀通过影响Smad7表达和细胞凋亡的肾脏保护作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物模型 清洁级SD雄性大鼠36只，体质量180~200 g，自由进食、饮水，适应1周后，随机分为3组,12只/组：第1组为阿霉素肾病组，尾静脉一次性注射阿霉素(法玛西亚公司产品)7.5 mg/kg; 第2组为辛伐他汀治疗组，同第1组处理后第2天起予辛伐他汀10 mg/(kg•d)灌胃；第3组为正常对照组。第4、8周后，收集24 h尿液，测定尿蛋白排泄量，经心脏取血送全自动血生化分析仪测血清肌酐、尿素氮，称肾重，取肾皮质按下述处理。
1.2 光镜检查 取标本置10%甲醛中固定后制成石蜡切片，行常规HE、PAS染色后于光学显微镜下观察肾脏病理形态学改变。
1.3 RT-PCR 取液氮保存的肾皮质，按TRIzol reagent(Life Technologies公司产品)方法提取总RNA，用MMLV逆转录酶(Promega产品)逆转录为cDNA,于PCRprint扩增仪上扩增。引物由北京赛百盛公司合成，Smad7引物序列：正义5′-GGA GTC CTT TCC TCT CTC-3′,反义5′-GGC TCA ATG AGC ATG CTC AC-3′。以GAPDH为内参照：正义5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′,反义5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′。PCR反应为94℃ 45 s,50℃ 45 s,72℃ 45 s,共30个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，用德国VL凝胶成像及分析系统进行摄像并半定量分析，Smad7产物为130 bp，GAPDH产物为309 bp，以对GAPDH相对值记录结果。
1.4 免疫组化 石蜡切片用SP免疫组化法(SP免疫组化试剂盒购自北京中山公司)测定Smad7蛋白的定位和表达，多克隆兔抗鼠Smad7购自Santa Cruz公司，工作浓度1：50。用同济千屏影像工程公司HPIAS2000型图像分析软件行图像分析，高倍镜下每张切片随机选取5个视野分析肾小管阳性区域的灰度值。
1.5 TUNEL法测定细胞凋亡 按TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司产品)方法测定各组肾皮质的凋亡细胞，光镜下每张切片至少随机选取5个视野计数肾小管上皮细胞凋亡细胞数，记录阳性率。
1.6 统计学方法 实验数据以(x±s)表示，用SPSS11.0统计软件对各组同期的Smad7 mRNA、蛋白水平进行组间方差分析，将Smad7 mRNA、蛋白的表达水平分别与凋亡阳性细胞率作双变量相关分析，P<0.05，表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠生化指标 肾病组尿蛋白排泄明显高于正常对照组，而治疗组尿蛋白低于肾病组(P<0.05)。各组血清肌酐、尿素氮值无明显差异。肾病组肾重/体质量值明显高于治疗组及对照组(P<0.05)。见表1。, http://www.100md.com(尤燕舞 林 栩 王 洁 郭鹏威)