钛颗粒刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子对人工关节松动的作用(2)
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1.2.2 Western blot(蛋白质印迹) 将RAW 264.7细胞用钛颗粒处理后，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5%去氧胆酸及50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)中，室温下1 h，离心10 min(13 000转/min)，取上清液，检测蛋白浓度。将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3 min，分别加入4%~15% 十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45~60 min(电压200 V)。将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜，在90 V电压下转移1 h，将其置于5%无脂牛奶中1 h(去除非特异性染色)后取出，加第1抗体-ERK/JNK/IkBa(抗体稀释液：1%小牛血清、Tris盐溶液、0.5% Tween 20)于硝酸纤维膜，4℃过夜，漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体，再置室温1 h，漂洗3次，用放射自显影法显影，Kodak X胶片摄影。Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较。
1.2.3 EMSA(凝胶迁移率实验) 准备细胞核提取液[8]。蛋白浓度用BCA试剂盒测定。凝胶迁移测定方法按Promega 公司说明书进行。7 μg 核抽提液与1 μg poly d(I-C)含50 000~100 000 cpm 32P标记的AP-1/NF-κB置25 μg的结合缓冲液(10 mM Tris-HCl,pH 7.5,100 mM NaCl,1 mM DTT,和4%甘油)于室温30 min，形成的复合物在0.5×TBE缓冲液(50 mM Tris-HCl,pH 8.5,50 mM硼酸,和1 mM EDTA)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并凝胶在真空中变干60 min后 X 胶片摄影。
1.2.4 统计学方法 统计分析用SPSS 11.0并完全随机设计的单因素方差分析 ......
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