抗HBV G145R HBsAg多克隆抗体的制备与鉴定(1)
【摘要】 目的 实验性rG145R变异抗HBs多克隆抗体。方法 采用纯化全基因重组G145R变异HBsAg常规皮下免疫制备小鼠多克隆抗体，以间接ELISA、SDS-PAG及Western blot等多种实验对制备物进行鉴定，并初步应用于转染CHO细胞的化学染色。结果 制备物在Western blot、ELISA中和试验与抗原替代ELISA中与重组G145R变异HBsAg及重组野生HBsAg等均有很好的特异性与反应性；对此两种抗原的ELISA效价前者显著高于后者(分别为51200与6400)；将其用于2A8细胞(转染并分泌G145R HBsAg)爬片的PAP染色，亦取得较理想的实验结果。结论 采用重组G145R变异HBsAg免疫成功制备出较高效价的抗体。鉴于该抗体同时与野生重组wHBsAg存在较强交叉反应，其与野生抗HBs的混合应用能增ELISA免疫逃逸变异的检测能力。
【关键词】乙型肝炎病毒；基因变异；合成肽；多克隆抗体
The preparation and identification of anti-HBV G145R HBsAg polyclonal antibody
, 百拇医药
LI Pei-shan，GONG Jing-song，LI Shi-jun，et al.
Biological Technology Group Corporation, Wuhan Institute of Biological Products，Hubei430060，China
【Abstract】 Objective To prepate the mouse polyclonal Anti G145R rHBsAb and analyze its immunological characteristics. Methods The recombinant G145R mutant HBsAg were respectively used to develop poly-clonal antibodys through immunize BALB/c rats, and the polyclonal antibody were confirmed by empirical methods, include western blot, ELISA and SDS PAGE, and preliminary used in chemical staining for the CHO.Results The recombinant G145R mutant HbsAb poly were indentified by western blot and ELISA, it showed a good specific reaction performence to both of G145R rHBsAg and r-wHBsAg. And the potency of the reaction with G145R rHBsAg was obviously higher than r-wHBsAg(they were 51200 and 6400).And it had a good result of the PAP staining of cell 2A8 also. ConclusionThe satisfactory antibody could be created by immunizing with G145R rHBsAg. Because of the cross reaction with r-wHBsAg, the recombinant G145R mutant HbsAb poly which is mixed with r-wHBsAg can enhance the detectivity of ELISA.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B virus; Gene variation ;Synthetic peptide; Polyclonal antibody
HBV具有较高的变异趋势，发生在S蛋白“a”决定簇基因区段的突变可能导致其HBsAg抗原性改变而形成免疫逃逸株(immune escape mutant strain, IEMS)[1]。由S基因第nt 587位G-A突变所产生G145R变异株(G145R IEMS)是其中发生频率最高，抗原性飘逸最彻底的IEMS之一[1～4]。受实验材料限制，对该变异的研究仅限于其变异机制及其分子流行病学调查。为进一步拓展对其基础与临床研究范围，笔者进行抗重组G145R变异S蛋白多克隆抗体(抗rG145R HBs poly)的制备研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料 重组G145R变异S蛋白(r-G145R-HBsAg)由同济医院医学实验中心采用亲和层析法制备[3]；HBsAg “a”决定簇合成多肽(G145R-SP24，包含123～147位氨基酸)、腺病毒抗原初提物(ADV-Ag)、2A8细胞爬片以及PAP染色试剂等由同济医院医学实验中心提供；HRP标记羊抗鼠IgG(GAM-HRP)购自Sigma公司。抗HBs A11 McAb，野生重组全基因HBsAg(r-wHBsAg，CHO细胞分泌)及其狂犬疫苗前体等由本所制备。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)为Gibico公司产品；CNBr-activated Sepharose 4B为Amersham Pharmacia Biotech 公司产品。BALB/c小鼠(8周龄，雌性)由湖北省疾病预防与控制中心动物室供应。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 动物免疫 取纯化r-G145R-HBsAg(50 μg/ml)适量，加等体积福氏完全佐剂，乳化后于5只BALB/c小鼠背部皮下多点注射，每只小鼠每次注射0.2 ml(5.0 μg)。2周后取同上r-G145R-HBsAg，加等体积福氏不完全佐剂乳化，背部皮下多点注射；间隔2周同上以做加强免疫共3次。末次免疫后10 d试血及采血，分离血清置-20℃冻存。另取5只BALB/c小鼠同上法进行r-wHBsAg免疫。
1.2.2 抗体鉴定 抗rG145R HBs效价检测采用间接ELISA，中和试验及其包被抗原取代试验在间接ELISA的基础上进行。具体操作参照文献及本室既往报道[3]：抗体纯度鉴定采用weistern blot，操作参照文献[3]；PAP细胞组化染色根据既往报道方法[3]。
, 百拇医药 2 结果
2.1 动物免疫结果 以rG145R-HBsAg及r-wtHBsAg两者分别免疫(共4次)实验动物。末次免疫后10 d自眼眶采血，分离血清置-20℃冻存。将所采集血清按组等体积混合，采用间接ELISA进行效价检测，结果见表1。
2.2 抗rG145R HBs(poly)的特异性鉴定
2.2.1 抗原取代实验 以rG145R-HBsAg、r-wtHBsAg、G145R-SP24、ADV及狂犬疫苗前体等为抗原(10 μg/ml)包被反应板，分别与抗rG145R HBs poly及抗r-wHBs Poly作间接ELISA，比较该抗体其与不同抗原的反应性，实验结果见图1。, 百拇医药(李佩珊 龚劲松 李时君 张 波 陈 妍 项美娟 李方和)
【关键词】乙型肝炎病毒；基因变异；合成肽；多克隆抗体
The preparation and identification of anti-HBV G145R HBsAg polyclonal antibody
, 百拇医药
LI Pei-shan，GONG Jing-song，LI Shi-jun，et al.
Biological Technology Group Corporation, Wuhan Institute of Biological Products，Hubei430060，China
【Abstract】 Objective To prepate the mouse polyclonal Anti G145R rHBsAb and analyze its immunological characteristics. Methods The recombinant G145R mutant HBsAg were respectively used to develop poly-clonal antibodys through immunize BALB/c rats, and the polyclonal antibody were confirmed by empirical methods, include western blot, ELISA and SDS PAGE, and preliminary used in chemical staining for the CHO.Results The recombinant G145R mutant HbsAb poly were indentified by western blot and ELISA, it showed a good specific reaction performence to both of G145R rHBsAg and r-wHBsAg. And the potency of the reaction with G145R rHBsAg was obviously higher than r-wHBsAg(they were 51200 and 6400).And it had a good result of the PAP staining of cell 2A8 also. ConclusionThe satisfactory antibody could be created by immunizing with G145R rHBsAg. Because of the cross reaction with r-wHBsAg, the recombinant G145R mutant HbsAb poly which is mixed with r-wHBsAg can enhance the detectivity of ELISA.
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【Key words】 Hepatitis B virus; Gene variation ;Synthetic peptide; Polyclonal antibody
HBV具有较高的变异趋势，发生在S蛋白“a”决定簇基因区段的突变可能导致其HBsAg抗原性改变而形成免疫逃逸株(immune escape mutant strain, IEMS)[1]。由S基因第nt 587位G-A突变所产生G145R变异株(G145R IEMS)是其中发生频率最高，抗原性飘逸最彻底的IEMS之一[1～4]。受实验材料限制，对该变异的研究仅限于其变异机制及其分子流行病学调查。为进一步拓展对其基础与临床研究范围，笔者进行抗重组G145R变异S蛋白多克隆抗体(抗rG145R HBs poly)的制备研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料 重组G145R变异S蛋白(r-G145R-HBsAg)由同济医院医学实验中心采用亲和层析法制备[3]；HBsAg “a”决定簇合成多肽(G145R-SP24，包含123～147位氨基酸)、腺病毒抗原初提物(ADV-Ag)、2A8细胞爬片以及PAP染色试剂等由同济医院医学实验中心提供；HRP标记羊抗鼠IgG(GAM-HRP)购自Sigma公司。抗HBs A11 McAb，野生重组全基因HBsAg(r-wHBsAg，CHO细胞分泌)及其狂犬疫苗前体等由本所制备。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)为Gibico公司产品；CNBr-activated Sepharose 4B为Amersham Pharmacia Biotech 公司产品。BALB/c小鼠(8周龄，雌性)由湖北省疾病预防与控制中心动物室供应。
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1.2 实验方法
1.2.1 动物免疫 取纯化r-G145R-HBsAg(50 μg/ml)适量，加等体积福氏完全佐剂，乳化后于5只BALB/c小鼠背部皮下多点注射，每只小鼠每次注射0.2 ml(5.0 μg)。2周后取同上r-G145R-HBsAg，加等体积福氏不完全佐剂乳化，背部皮下多点注射；间隔2周同上以做加强免疫共3次。末次免疫后10 d试血及采血，分离血清置-20℃冻存。另取5只BALB/c小鼠同上法进行r-wHBsAg免疫。
1.2.2 抗体鉴定 抗rG145R HBs效价检测采用间接ELISA，中和试验及其包被抗原取代试验在间接ELISA的基础上进行。具体操作参照文献及本室既往报道[3]：抗体纯度鉴定采用weistern blot，操作参照文献[3]；PAP细胞组化染色根据既往报道方法[3]。
, 百拇医药 2 结果
2.1 动物免疫结果 以rG145R-HBsAg及r-wtHBsAg两者分别免疫(共4次)实验动物。末次免疫后10 d自眼眶采血，分离血清置-20℃冻存。将所采集血清按组等体积混合，采用间接ELISA进行效价检测，结果见表1。
2.2 抗rG145R HBs(poly)的特异性鉴定
2.2.1 抗原取代实验 以rG145R-HBsAg、r-wtHBsAg、G145R-SP24、ADV及狂犬疫苗前体等为抗原(10 μg/ml)包被反应板，分别与抗rG145R HBs poly及抗r-wHBs Poly作间接ELISA，比较该抗体其与不同抗原的反应性，实验结果见图1。, 百拇医药(李佩珊 龚劲松 李时君 张 波 陈 妍 项美娟 李方和)