抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱研究(1)
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【摘要】 目的 研究抗癌活性肽对人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱，筛选与抗癌活性肽作用相关的基因表达改变。方法 将1152条人类全长基因的PCR产物按微矩阵排列点样于特殊处理的玻片上制备成表达谱芯片；按一步法抽提抗癌活性肽作用前后体外培养的胆囊癌细胞的RNA并纯化mRNA，通过逆转录用两种荧光Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记对照和实验组胆囊癌细胞cDNA，制成cDNA探针并与表达谱芯片杂交，用ScanArray4000扫描仪扫描芯片上两种荧光信号，计算机分析判定差异表达的基因。结果 在1152条基因中筛选出有差异表达的基因245条，其中上调的121条，下调的124条。结论 利用本基因表达谱芯片可同时研究数以千计的基因表达水平，从而在基因水平上探讨抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用的机制。
【关键词】 抗癌活性肽；胆囊癌；细胞系；基因芯片；基因表达谱
Analysis of gene expression pattern in gallbladder carcinoma cells treated by anti-cancer bioactive peptide (ACBP) YUN Qiang，SU Xiu-lan，OU YANG Xiao-hui.Inner Mongolia Hospital，Inner Mongolia 100027，China
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【Abstract】 Objective To investigate gene expression pattern of human gallbladder carcinoma cell line treated by anti-cancer bioactive peptide (ACBP)，and in the identification of novel cance rassociated genes.Methods The cDNA retro-transcribed from equal quantity mRNA from the gallbladder carcinoma cell line (GBC-SD) which were labeled with Cy5 and Cy3 fluorescence as a probes.The mixed probe was hybridized with cDNA microarray which representing a set of 1152 human genes.It was scanned by laser scanner.The acquired image was analyzed by software.Results 245 differentially expressed genes were identified that further identified 121 upregulated and 124 downregulated gene.Conclusion cDNA microarray for analysis of gene expression patterns is a powerful method to identify nove cancer as sociated genes.
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【Key words】 Anti-cancer bioactive peptide (ACBP)；Gallbladder carcinoma；Cell line；Gene chip；Gene expression pattern
本研究将通过基因芯片技术比较分析抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞的基因表达谱的影响，了解作用前后基因表达的变化，深入探讨这种新型生物活性制剂的分子机制，为肿瘤治疗提供新方法。
1 材料与方法
1.1 细胞株 人胆囊癌GBC-SD细胞由山东大学齐鲁医院肿瘤研究所保存并提供。
1.2 主要试剂与耗材
1.2.1 细胞培养相关试剂
1.2.2 细胞总RNA提取、分析试剂
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1.2.3 基因芯片标记、杂交试剂盒 上海博星(BioStar)基因芯片有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养与药物作用 胆囊癌细胞按适当密度接种于培养瓶内常规培养，当达到80%融合时，加入活性肽使终浓度达到8 mg/ml继续培养48 h开始有形态的改变时终止。
1.3.2 探针制备 用改进的Trizol试剂一步法抽提培养细胞总RNA。
1.3.3 芯片杂交洗涤 按杂交试剂盒说明操作。
1.3.4 检测与分析 用ScanArray4000扫描仪扫描芯片，用GenePix Pro3.0图象分析软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。
2 结果
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2.1 总RNA抽提结果 所提两组细胞(GBC-SD细胞对照组、GBC-SD细胞实验组)RNA OD260/OD280：1.8～2.0；1%琼脂糖凝胶电泳28 s、18 s条带清晰，无DNA杂带，证明已抽提高纯化的细胞总RNA。
2.2 芯片杂交结果分析
2.3 基因芯片检测结果 总基因位点1152条，归一化选择后基因总数1010条，有差异表达的基因245条，占基因总数的21.27%。其中经活性肽诱导后表达降低的124条，表达增高的121条。
3 讨论
利用基因芯片技术可以大规模、高通量、快速高效的对大量基因进行同时研究。表达谱基因芯片是用于基因功能研究的一种芯片，对来源于不同下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，计算机分析检测结果，对基因表达进行综合的分析和判断，将某个或几个基因与疾病联系起来。
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肿瘤的发生、发展是多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程，利用基因芯片技术可以平行检测数千条基因，了解药物对基因表达的影响，从而推测药物作用的基因靶点及机制，有利于发挥生物制剂特异性靶向调节作用。
3.1 缺氧诱导因子-1(HIF-1)反应性基因RTP801和内皮素1(ET-1)表达降低 HIF-1在多数肿瘤细胞中高表达，上调参与肿瘤增殖和代谢通路的靶基因。其机制主要是通过提高葡萄糖转运、糖酵解速率及形成多血管体系来使肿瘤细胞适应缺氧的环境[2]。其功能可分为：①促进糖酵解：能使肿瘤细胞适应不利环境，减少有氧代谢中氧自由基对DNA复制的破坏；②促进新生血管生成，给瘤细胞的侵袭和转移创造条件[3]；③慢性缺氧状态下，HIF-1α可能参与诱导细胞凋亡。Nip是Bcl-2凋亡家族的凋亡前成员，它的启动子中包含HIF-1反应元件。在慢性缺氧及强制表达HIF-1α时均可使Nip3表达活跃，启动Bcl-2诱导细胞凋亡[4]；④其他：HIF-1还可诱导各种促红细胞生成因子(如EPO、转铁蛋白)、扩血管因子(如诱导型一氧化氮合酶)、内皮素1等的表达来增加组织氧的运输和利用能力。拮抗HIF-1能抑制血管增生和肿瘤生长。RTP801是一个新克隆的HIF-1反应性基因，在体外和体内缺血性动物模型都可以检测到RTP801表达增高，将含有RTP801cDNA的脂质体导入小鼠肺内可导致大量细胞死亡[5]。内皮素是由内皮细胞和血管平滑肌细胞产生的含有21个氨基酸残基的短肽，有四种亚型，有强烈的缩血管作用，ET-1作用最强。现已证实，多数肿瘤能产生ET-1并表达内皮素受体，内皮素可通过多种途径参与肿瘤的血管生成[6]。推测活性肽能通过抑制肿瘤血管形成和影响肿瘤细胞能量代谢，促进凋亡而起到抗肿瘤效应。, http://www.100md.com(云 强 苏秀兰 欧阳晓晖)