Id1 miRNA表达载体构建与转染乳腺癌细胞(2)
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1.2.3 分组转染乳腺癌细胞MDA-MB231细胞株及稳定转染细胞株的筛选
用Qiagen Tip100 Plasmid Midi 纯化试剂盒大量抽提高纯度质粒Id1-pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR、及阴性对照质粒(Negative control)。取所获DNA 5μl，60倍稀释，以紫外分光光度计测定OD260、OD280及比值，确定浓度及纯度。MDA-MB231乳腺癌细胞以含10%小牛血清的DMEM高糖培养液，于75 ml细胞培养瓶中，37℃；5%CO2；100%湿度，培养箱中培养。每3~4 d，传代一次。同时用不同浓度杀稻瘟霉素杀伤细胞以确定合适的药物筛选浓度(6 ng/L)。转染前1 d，选取处于对数生长期的细胞，用台盼蓝染色计算MDA-MB231细胞存活率，选用存活率大于或等于97%细胞,随机分组，使用Lipofectamine2000作为转染介质，将三组质粒(No.2 ,No.3及negative control)分别转染三组乳腺癌MDA-MB231细胞中。无血清培养液培养5 h。吸弃转染混合液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液。37℃ 5%CO2 100%湿度培养箱中，培养48 h。弃上清，加入含6 μg/ml杀稻瘟霉素的DMEM高糖培养液 ......
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