中药指纹图谱在现代中药制剂中的应用(1)
【关键词】 指纹图谱;中药制剂;原料药
中药是中国人民数千年积累的财富,随着国际医药产业竞争日益激烈,对传统中药产业提出了现代化和国际化的要求,这就要求我们传统中药的质量控制方法也要更加完善,只有这样才能让中药走向国际市场。
中药为多成分体系,其药效是众多单一的活性化学成分的协同综合作用,甚至某些“非活性成分”也起重要的协同作用,体现了中医理论“整体观念”和“辨证施治”的精髓,因此,利用中药指纹图谱质量评价体系分析中药成分的整体特性是目前大家所关注的。
1 中药指纹图谱的概念和分类
1.1 概念 中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药经适当的处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标志该中药材或中成药特征的色谱或光谱的图谱。指纹图谱的作用主要是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。广义的中药指纹图谱包括化学指纹图谱和DNA指纹图谱,狭义的指纹图谱仅指化学指纹图谱。本文所指的中药指纹图谱指前者,它是目前国内外广泛接受的一种中药质量控制模式和技术,同时也是中药理论研究与新药开发的研究模式和体系。
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1.2 分类 ①按应用对象分类:可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。中药材指纹图谱按测定手段又可分为化学(成分)指纹图谱和DNA指纹图谱[1];②按测定手段分类:可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱系指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。光谱最常用的是红外光谱(IR)。色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。其他方法包括波谱[质谱(MS)和核磁共振谱(NMR)]和联用技术[25]。
2 中药指纹图谱在控制原料药材质量中的地位和重要性
国际社会对药品的要求是“安全、有效、经济”,对于中成药这样的物质群的质量控制方法近20年来也日趋共识[6]。WHO草药评价指导原则中规定,如果草药的活性成分不能鉴别,可以通过色谱指纹图谱证明产品质量的一致。中国国家食品药品监督管理局要求到2002年末,所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料,包括中药原料、提取物、产品,3种图谱的峰形必须有相关性,否则不予受理。这对推动中药现代化、产业化和国际化具有重大作用,可确立中药在国际医药学界应有的地位。
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中药化学成分的多样性和复杂性是发挥其疗效的物质基础,同时也是质量评价的重点与难点。在现阶段,建立全面反映所含化学成分的指纹图谱,将更有效的体现中药成分的复杂性,从而更好的评价中药的质量[7]。
3 研究实施中药指纹图谱的重要环节是制剂工艺的规范和优化
中国卫生部原颁发的药品标准收载的许多老产品和新的三类中成药产品的生产工艺大部分简单粗糙,既难以保证产品的稳定,更无法提供高质量产品,必然对指纹图谱研究增加困难。中药注射剂由于剂型的需要,生产工艺相对精细,“杂质”相对较少,但工艺是否稳定还是需要注意的问题。欧洲草药制剂的生产工艺大多以“标准浸膏”投料[8],减少了以草药作起始原料带来的不稳定因素,甚至有厂家专门生产多种草药的“标准浸膏”提供给制剂厂。每种浸膏均附有质量标准,或按照制剂厂家的要求生产“标准浸膏”。将来至少中药注射剂的工艺将药材投料改为浸膏投料是不可避免的;以有效部位投料可能也是一种趋势。
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4 中药指纹图谱在制剂中的应用
4.1 光谱法
4.1.1 紫外光谱法(UV) 紫外吸收光谱主要用于化合物结构鉴定和含量测定。李守信等[11]采用二阶导数光谱法测定抗感颗粒中氯原子的含量。
4.1.2 红外光谱法(IR) 属于分子振动光谱,是有机分子的吸收光谱,可提供分子中有关官能团的内在信息,“指纹”对异构体有选择性,可进行定量及无损分析。虞科等[9]提出一种近红外漫反射光谱快速测定复方丹参滴丸有效成分的新方法,采用HPLC为对照分析法,对未知样本进行含量测定,可用于中药复方制剂有效成分的快速检测。
4.2 色谱法
4.2.1 薄层色谱法(TLC) 薄层色谱指纹图谱用固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描,所得的扫描图谱比目测的层析图谱更客观准确,具有快速,经济,可靠,操作简便,适用范围广,重现性好的优点。它的主要不足是“柱效”较低[10],对靠细微特征方可鉴别的指纹特征灵敏度也不够,对外部环境条件(温度,湿度)要求较高,操作要求规范,熟练。
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4.2.2 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法是运用较多的分析方法,60%～70%的有机物均可应用。高效液相色谱法与质谱(MS)联用,能够将未知成分的各峰进行归属。张力新等[11]用高效液相色谱法对肾康注射液中的主要大黄进行分析,确定了大黄药材的指纹图谱分析方法。
4.2.3 气相色谱法(GC) 气相色谱法具有高效,高选择性,高灵敏度,进样量小且分析速度快等优点,但样品必须具有一定挥发性及热稳定性,因此限制了其应用范围,其主要应用于一些挥发性成分的鉴定。气相色谱指纹图谱主要应用于含挥发性成分较多的中药材及中药制剂的质量鉴定和质量控制。冯毅凡等[12]对华佗再造丸及其主要药味红花、川芎、当归、天南星、冰片、吴茱萸的石油醚提取物进行了气相色谱分析,获取了其GC指纹图谱,并根据其指纹特征对华佗再造丸进行质量评价。
4.2.4 高速逆流色谱法(HSCCC) HSCCC是当前国际流行的新型的液液分配技术,具有很好的适应性。其分离度和重现性与HPLC基本相同,但它操作更为简便,容易掌握,对样品的预处理要求低,仅需一般粗提物即可,该技术的回收率高,能实现梯度操作,易能重复进样。沈平孃[13]利用HSCCC技术对多种中药进行了指纹分析都得到了较好效果,可用于中药的质量控制和分析。
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4.2.5 高效毛细管电泳法(HPCE) 本法具有分离模式多,分离效率高,速度快,适用范围广,所需样品量和试剂量少等优点。戴开金等[14]采用HPCE构建了黄连药材及葛根苏连汤中黄连生物碱的指纹图谱,作为控制黄连药材及葛根苏连制剂的内在质量标准。
4.3 X射线衍射法(XRD) 当某一物质进行衍射分析时,该物质被X射线照射而产生不同程度的衍射现象。X衍射指纹图谱具有指纹性强,能立即知道样品成分,图谱稳定可靠等特点。刘小平等[15]通过对8份样品的Fourier图谱分析鉴定,获得六味地黄丸的标准X射线衍射Fourier指纹图谱及特征标记峰值,建立中药六味地黄丸的新鉴定方法。
4.4 核磁共振波谱法(NMR) 核磁共振波谱是一种物理方法,它检测的是组成有机化合物分子的原子核的性质及其周围化学环境的相互作用。在适当的磁场条件下,样品能够吸收射频区的电磁辐射。所吸收的辐射频率取决于样品特性,吸收与分子中某一给定的原子核有关,吸收峰频率对吸收峰强度作图构成NMR谱图。主要应用领域是测定分子的结构。
4.5 色谱联用技术 色谱联用技术的出现加快了中药研发的步伐。目前正处于快步发展阶段并广泛应用的色谱联用技术包括气相色谱/质谱联用(GCMS)、液相色谱/质谱联用(LCMS)、液相色谱/质谱/质谱联用(LCMSMS)、毛细管电泳/质谱联用(CEMS)、电感耦合等离子体/质谱联用(ICPMS)等。将色谱法良好的分离技术和波谱法特有的结构鉴别能力相结合,已成为非常有效的分离鉴定手段。曹进等[16]利用液质联用技术对桂枝汤的A部分进行了多维多息化学特征的指认,通过质谱中质荷比(m/z)值及HPLC的保留时间的相互对照,将桂枝汤A部分中的主要成分进行归属。, http://www.100md.com(高华荣 孙相民)
中药是中国人民数千年积累的财富,随着国际医药产业竞争日益激烈,对传统中药产业提出了现代化和国际化的要求,这就要求我们传统中药的质量控制方法也要更加完善,只有这样才能让中药走向国际市场。
中药为多成分体系,其药效是众多单一的活性化学成分的协同综合作用,甚至某些“非活性成分”也起重要的协同作用,体现了中医理论“整体观念”和“辨证施治”的精髓,因此,利用中药指纹图谱质量评价体系分析中药成分的整体特性是目前大家所关注的。
1 中药指纹图谱的概念和分类
1.1 概念 中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药经适当的处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标志该中药材或中成药特征的色谱或光谱的图谱。指纹图谱的作用主要是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。广义的中药指纹图谱包括化学指纹图谱和DNA指纹图谱,狭义的指纹图谱仅指化学指纹图谱。本文所指的中药指纹图谱指前者,它是目前国内外广泛接受的一种中药质量控制模式和技术,同时也是中药理论研究与新药开发的研究模式和体系。
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1.2 分类 ①按应用对象分类:可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。中药材指纹图谱按测定手段又可分为化学(成分)指纹图谱和DNA指纹图谱[1];②按测定手段分类:可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱系指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。光谱最常用的是红外光谱(IR)。色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。其他方法包括波谱[质谱(MS)和核磁共振谱(NMR)]和联用技术[25]。
2 中药指纹图谱在控制原料药材质量中的地位和重要性
国际社会对药品的要求是“安全、有效、经济”,对于中成药这样的物质群的质量控制方法近20年来也日趋共识[6]。WHO草药评价指导原则中规定,如果草药的活性成分不能鉴别,可以通过色谱指纹图谱证明产品质量的一致。中国国家食品药品监督管理局要求到2002年末,所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料,包括中药原料、提取物、产品,3种图谱的峰形必须有相关性,否则不予受理。这对推动中药现代化、产业化和国际化具有重大作用,可确立中药在国际医药学界应有的地位。
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中药化学成分的多样性和复杂性是发挥其疗效的物质基础,同时也是质量评价的重点与难点。在现阶段,建立全面反映所含化学成分的指纹图谱,将更有效的体现中药成分的复杂性,从而更好的评价中药的质量[7]。
3 研究实施中药指纹图谱的重要环节是制剂工艺的规范和优化
中国卫生部原颁发的药品标准收载的许多老产品和新的三类中成药产品的生产工艺大部分简单粗糙,既难以保证产品的稳定,更无法提供高质量产品,必然对指纹图谱研究增加困难。中药注射剂由于剂型的需要,生产工艺相对精细,“杂质”相对较少,但工艺是否稳定还是需要注意的问题。欧洲草药制剂的生产工艺大多以“标准浸膏”投料[8],减少了以草药作起始原料带来的不稳定因素,甚至有厂家专门生产多种草药的“标准浸膏”提供给制剂厂。每种浸膏均附有质量标准,或按照制剂厂家的要求生产“标准浸膏”。将来至少中药注射剂的工艺将药材投料改为浸膏投料是不可避免的;以有效部位投料可能也是一种趋势。
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4 中药指纹图谱在制剂中的应用
4.1 光谱法
4.1.1 紫外光谱法(UV) 紫外吸收光谱主要用于化合物结构鉴定和含量测定。李守信等[11]采用二阶导数光谱法测定抗感颗粒中氯原子的含量。
4.1.2 红外光谱法(IR) 属于分子振动光谱,是有机分子的吸收光谱,可提供分子中有关官能团的内在信息,“指纹”对异构体有选择性,可进行定量及无损分析。虞科等[9]提出一种近红外漫反射光谱快速测定复方丹参滴丸有效成分的新方法,采用HPLC为对照分析法,对未知样本进行含量测定,可用于中药复方制剂有效成分的快速检测。
4.2 色谱法
4.2.1 薄层色谱法(TLC) 薄层色谱指纹图谱用固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描,所得的扫描图谱比目测的层析图谱更客观准确,具有快速,经济,可靠,操作简便,适用范围广,重现性好的优点。它的主要不足是“柱效”较低[10],对靠细微特征方可鉴别的指纹特征灵敏度也不够,对外部环境条件(温度,湿度)要求较高,操作要求规范,熟练。
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4.2.2 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法是运用较多的分析方法,60%～70%的有机物均可应用。高效液相色谱法与质谱(MS)联用,能够将未知成分的各峰进行归属。张力新等[11]用高效液相色谱法对肾康注射液中的主要大黄进行分析,确定了大黄药材的指纹图谱分析方法。
4.2.3 气相色谱法(GC) 气相色谱法具有高效,高选择性,高灵敏度,进样量小且分析速度快等优点,但样品必须具有一定挥发性及热稳定性,因此限制了其应用范围,其主要应用于一些挥发性成分的鉴定。气相色谱指纹图谱主要应用于含挥发性成分较多的中药材及中药制剂的质量鉴定和质量控制。冯毅凡等[12]对华佗再造丸及其主要药味红花、川芎、当归、天南星、冰片、吴茱萸的石油醚提取物进行了气相色谱分析,获取了其GC指纹图谱,并根据其指纹特征对华佗再造丸进行质量评价。
4.2.4 高速逆流色谱法(HSCCC) HSCCC是当前国际流行的新型的液液分配技术,具有很好的适应性。其分离度和重现性与HPLC基本相同,但它操作更为简便,容易掌握,对样品的预处理要求低,仅需一般粗提物即可,该技术的回收率高,能实现梯度操作,易能重复进样。沈平孃[13]利用HSCCC技术对多种中药进行了指纹分析都得到了较好效果,可用于中药的质量控制和分析。
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4.2.5 高效毛细管电泳法(HPCE) 本法具有分离模式多,分离效率高,速度快,适用范围广,所需样品量和试剂量少等优点。戴开金等[14]采用HPCE构建了黄连药材及葛根苏连汤中黄连生物碱的指纹图谱,作为控制黄连药材及葛根苏连制剂的内在质量标准。
4.3 X射线衍射法(XRD) 当某一物质进行衍射分析时,该物质被X射线照射而产生不同程度的衍射现象。X衍射指纹图谱具有指纹性强,能立即知道样品成分,图谱稳定可靠等特点。刘小平等[15]通过对8份样品的Fourier图谱分析鉴定,获得六味地黄丸的标准X射线衍射Fourier指纹图谱及特征标记峰值,建立中药六味地黄丸的新鉴定方法。
4.4 核磁共振波谱法(NMR) 核磁共振波谱是一种物理方法,它检测的是组成有机化合物分子的原子核的性质及其周围化学环境的相互作用。在适当的磁场条件下,样品能够吸收射频区的电磁辐射。所吸收的辐射频率取决于样品特性,吸收与分子中某一给定的原子核有关,吸收峰频率对吸收峰强度作图构成NMR谱图。主要应用领域是测定分子的结构。
4.5 色谱联用技术 色谱联用技术的出现加快了中药研发的步伐。目前正处于快步发展阶段并广泛应用的色谱联用技术包括气相色谱/质谱联用(GCMS)、液相色谱/质谱联用(LCMS)、液相色谱/质谱/质谱联用(LCMSMS)、毛细管电泳/质谱联用(CEMS)、电感耦合等离子体/质谱联用(ICPMS)等。将色谱法良好的分离技术和波谱法特有的结构鉴别能力相结合,已成为非常有效的分离鉴定手段。曹进等[16]利用液质联用技术对桂枝汤的A部分进行了多维多息化学特征的指认,通过质谱中质荷比(m/z)值及HPLC的保留时间的相互对照,将桂枝汤A部分中的主要成分进行归属。, http://www.100md.com(高华荣 孙相民)