中药材中蛋白质含量测定方法的研究
近年来,随着基因工程学、分子生物学和现代分离技术的快速发展,蛋白质也成了一项质量和资源评价的指标,故探索测定蛋白质含量的方法有着重要的意义[1]。目前测定蛋白质含量的常用方法有凯氏定氮法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法、双缩脲法、Folin酚试剂法和双辛可宁酸法[2]等。这些方法也分别应用于测定不同中药材中蛋白质含量。
1 考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝法是 Bradford于1975年建立的一种色素结合法。其主要原理是考马斯亮蓝G250在酸性溶液中与蛋白质通过范德瓦尔引力结合形成最大吸收峰为595 nm的复合物,其吸光度与蛋白质含量在200～1400 μg/ml之间呈线性关系,故可用于蛋白质含量的测定[3]。赵英永[1]等探讨了考马斯亮蓝G250染色法测定草乌药材中可溶性蛋白质含量的方法,并建立了快速、灵敏的测定蛋白质的方法。
由于植物粗提液中含有许多其他物质,如酚类物质、核酸等,而且蛋白质的含量比较低,因而诸如Folin酚法,双缩脲法,紫外吸收法等的应用受到了一定的限制,而考马斯亮蓝法灵敏度高,操作简便,特异性强,快速,且不受酚类物质的影响,因而常常在植物组织粗提液中可溶性蛋白质含量的测定中被采用[4]。但是,目前还不清楚是否所有的植物蛋白质都可以用这种方法测定[5]。
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2 凯氏定氮法
凯氏定氮法 [6]为经典的测定蛋白质的方法。是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确的方法之一,被国际国内较多作为法定的标准检验方法[7]。周燕等[8]进行了八味沉香胶囊中总蛋白质的含量测定,结果可靠,精密度高,重现性好,可作为该品的质量控制方法。韩定献[9]等也采用此法进行了天力保胶囊中蛋白质和氨基酸的含量测定,测得蛋白质含量为23.00%。利用凯氏定氮法对金银花枝叶中蛋白质含量进行了测定,结果显示,金银花叶中的蛋白质含量与花中含量极为相近[10]。
虽然,凯氏定氮法为测定含氮量抽象算蛋白质的方法,测定结果的重复性和重现性都很好。但此法操作繁琐,试剂消耗量大,消化时排放的SO2对人体健康造成直接危害,而且费时、费电、费水。
3 双缩脲法
双缩脲法测定蛋白质含量的原理是,在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,这种紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定各种蛋白质含量[11]。汪良驹等[5]探讨了用此法测定银杏叶片可溶性蛋白质含量,结果表明双脲试剂与银杏叶片可溶性蛋白质反应迅速、稳定,适合于这种果树叶片可溶性蛋白质测定。应用双缩脲法测定决明子中蛋白质含量结果表明,决明子中蛋白质含量较高 [12]。
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4 Folin酚试剂法
Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高(比双缩脲法灵敏得多),缺点是费时间较长[13],要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。康东周[14]等认为用 Lowry 法测定蛋白质含量时,酚类、单糖类等干扰测定,因此需先经过蛋白沉淀的处理过程,排除干扰物质的影响。吴瑾瑾 [15]等采用Folin酚试剂法测定了康克胶囊中可溶性蛋白质的含量,结果蛋白质在25～300 μg/ml范围内呈良好的线性关系,r≥0.9990,方法灵敏、准确、重复性好。利用此法测定灵芝产品中多糖肽的含量,结论是本法稳定可靠、简便快速,可作为灵芝及其产品质量控制指标[16]。
5 紫外分光光度法
蛋白质分子中,一些氨基酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质在280 nm处有吸收,其光密度值与蛋白质含量成正比,可用于蛋白质含量的测定[11]。本方法定量过程中无试剂加入,蛋白可回收,且方法简便[17]。曹艳等[18]用紫外吸收法测定了半夏总蛋白含量,结论是由于不同样品中干扰成分差异较大,致使280 nm紫外吸收法的准确性稍差。故本实验只适用于总蛋白的含量测定。因此,就含有大量复杂成分的中药材中蛋白质含量测定而言,最好是先进行蛋白纯化后在用紫外分光光度法测定。
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6 其他方法
随着蛋白质组学研究技术的深入发展,蛋白质组学在基础研究、农业、医药学研究中得到广泛的利用,近年来也应用于中药材鉴别和蛋白质的半定量。如在二维电泳基础上的染色方法进行蛋白质的定量是应用较多的方法之一。唐任能[19]等采用SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳和BCA蛋白含量测定法比较了鹿茸、鹿托盘、鹿骨水溶性总蛋白差异。结论是SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳法及BCA蛋白含量测定法是鉴别鹿茸、鹿托盘及鹿骨有效方法。另外,利用凯氏定氮法对板蓝根、南板蓝根和大青叶的生药和相应的新鲜植物组织中的总蛋白含量进行测定,提取液中的蛋白质组分应用SDS2PAGE电泳进行分析,证实了三种药材的蛋白质种类和含量有一定差别,且同种药材的新鲜植物组织和生药蛋白质组分在含量和种类上有明显差别[20]。
7 结束语
总之,虽然蛋白质含量的测定方法很多,但是,还没有一个完美的测定中药材中蛋白质含量的方法。在选择方法时应考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度;中药材中蛋白质的性质;中药材中存在的干扰物质;测定所要花费的时间等各种因素。在选择测定方法时,可根据实验要求和实验室条件决定,从而选出适合且误差较小较准确的方法。
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参考文献
[1] 赵英永,戴云,崔秀明,等.考马斯亮蓝 G250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量. 云南民族大学学报(自然科学版), 2006,15(3):235.
[2] 李建武 ,萧能愿 ,余瑞元,等. 生物化学实验原理和方法 .北京大学出版社,1994: 160176.
[3] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantifies of protein utilizing the principle of protein dye binding.Anal Biochem,1976,7(72):248254.
[4] 曲春香,沈颂东,王雪峰,等. 用考马斯亮蓝测定植物粗提液中可溶性蛋白质含量方法的研究 . 苏州大学学报(自然科学版),2006,22(2):82.
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[5] 汪良驹 ,姜卫兵,祝海阔,等. 银杏叶片可溶性蛋白质测定非直线性原因分析.果树学报,2002,19(1):32.
[6] 回瑞华,侯冬岩,李学成,等.荞麦中蛋白质含量的分析.食品科学,2004,25(10):230232.
[7] 郭颖娜,孙卫. 蛋白质含量测定方法的比较.河北化工,2008,31(4):3637.
[8] 周燕,薄或坤,王玉华. 八味沉香胶囊中总蛋白质的含量测定. 内蒙古医学院学报,2007,29(6):426430.
[9] 韩定献,周军,徐辉碧. 天力保胶囊中蛋白质和氨基酸的含量测定.中成药,2005,27(2):224225.
[10] 景小琦,武雪芬,雷敬卫.金银花枝叶中粗黄酮、无机元素和蛋白质含量测定. 河南中医,2001,21(4):6667.
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[11] 杨玉芳. 蛋白质含量测定方法.明胶科学与技术,2007,27(2):99.
[12] 刘训红,王玉玺.决明子中营养成分分析.时珍国医国药,2000,11(10):865866.
[13] 薛志欣,杨桂朋,马晓梅,等. 分光光度法测定藻胆蛋白含量的研究.鲁东大学学报(自然科学版),2008,24(3):250253.
[14] 康东周,张善玉,全仙花. Lowry 法测定宫颈癌片中蛋白质的含量.现代医药卫生,2005,21(23):32103211.
[15] 吴瑾瑾,石森林. FolinLowry法测定康克胶囊可溶性蛋白质含量.浙江中医学院学报,2001,25(5):75.
[16] 陈颖,王赛贞,林树钱.用Folin酚法测定灵芝产品中多糖肽含量. 海峡药学,2007,19(7):3739.
[17] 陈毓荃.生物化学实验方法和技术.科学出版社,2002:8.
[18] 曹艳,黄必胜.半夏总蛋白含量的紫外吸收法测定. 湖北中医杂志,2005,27(7):48.
[19] 唐任能,赵雨,孙晓迪,等. 梅花鹿鹿茸、鹿托盘及鹿骨水溶性总蛋白比较研究. 吉林中医药,2008,28(4):295296.
[20] 项雷文 ,高观祯,汪惠勤,等. 板蓝根、南板蓝根及大青叶中蛋白质组分分析.中药材,31(3):390392., 百拇医药(张善玉 葛 娜)
1 考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝法是 Bradford于1975年建立的一种色素结合法。其主要原理是考马斯亮蓝G250在酸性溶液中与蛋白质通过范德瓦尔引力结合形成最大吸收峰为595 nm的复合物,其吸光度与蛋白质含量在200～1400 μg/ml之间呈线性关系,故可用于蛋白质含量的测定[3]。赵英永[1]等探讨了考马斯亮蓝G250染色法测定草乌药材中可溶性蛋白质含量的方法,并建立了快速、灵敏的测定蛋白质的方法。
由于植物粗提液中含有许多其他物质,如酚类物质、核酸等,而且蛋白质的含量比较低,因而诸如Folin酚法,双缩脲法,紫外吸收法等的应用受到了一定的限制,而考马斯亮蓝法灵敏度高,操作简便,特异性强,快速,且不受酚类物质的影响,因而常常在植物组织粗提液中可溶性蛋白质含量的测定中被采用[4]。但是,目前还不清楚是否所有的植物蛋白质都可以用这种方法测定[5]。
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2 凯氏定氮法
凯氏定氮法 [6]为经典的测定蛋白质的方法。是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确的方法之一,被国际国内较多作为法定的标准检验方法[7]。周燕等[8]进行了八味沉香胶囊中总蛋白质的含量测定,结果可靠,精密度高,重现性好,可作为该品的质量控制方法。韩定献[9]等也采用此法进行了天力保胶囊中蛋白质和氨基酸的含量测定,测得蛋白质含量为23.00%。利用凯氏定氮法对金银花枝叶中蛋白质含量进行了测定,结果显示,金银花叶中的蛋白质含量与花中含量极为相近[10]。
虽然,凯氏定氮法为测定含氮量抽象算蛋白质的方法,测定结果的重复性和重现性都很好。但此法操作繁琐,试剂消耗量大,消化时排放的SO2对人体健康造成直接危害,而且费时、费电、费水。
3 双缩脲法
双缩脲法测定蛋白质含量的原理是,在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,这种紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定各种蛋白质含量[11]。汪良驹等[5]探讨了用此法测定银杏叶片可溶性蛋白质含量,结果表明双脲试剂与银杏叶片可溶性蛋白质反应迅速、稳定,适合于这种果树叶片可溶性蛋白质测定。应用双缩脲法测定决明子中蛋白质含量结果表明,决明子中蛋白质含量较高 [12]。
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4 Folin酚试剂法
Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高(比双缩脲法灵敏得多),缺点是费时间较长[13],要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。康东周[14]等认为用 Lowry 法测定蛋白质含量时,酚类、单糖类等干扰测定,因此需先经过蛋白沉淀的处理过程,排除干扰物质的影响。吴瑾瑾 [15]等采用Folin酚试剂法测定了康克胶囊中可溶性蛋白质的含量,结果蛋白质在25～300 μg/ml范围内呈良好的线性关系,r≥0.9990,方法灵敏、准确、重复性好。利用此法测定灵芝产品中多糖肽的含量,结论是本法稳定可靠、简便快速,可作为灵芝及其产品质量控制指标[16]。
5 紫外分光光度法
蛋白质分子中,一些氨基酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质在280 nm处有吸收,其光密度值与蛋白质含量成正比,可用于蛋白质含量的测定[11]。本方法定量过程中无试剂加入,蛋白可回收,且方法简便[17]。曹艳等[18]用紫外吸收法测定了半夏总蛋白含量,结论是由于不同样品中干扰成分差异较大,致使280 nm紫外吸收法的准确性稍差。故本实验只适用于总蛋白的含量测定。因此,就含有大量复杂成分的中药材中蛋白质含量测定而言,最好是先进行蛋白纯化后在用紫外分光光度法测定。
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6 其他方法
随着蛋白质组学研究技术的深入发展,蛋白质组学在基础研究、农业、医药学研究中得到广泛的利用,近年来也应用于中药材鉴别和蛋白质的半定量。如在二维电泳基础上的染色方法进行蛋白质的定量是应用较多的方法之一。唐任能[19]等采用SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳和BCA蛋白含量测定法比较了鹿茸、鹿托盘、鹿骨水溶性总蛋白差异。结论是SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳法及BCA蛋白含量测定法是鉴别鹿茸、鹿托盘及鹿骨有效方法。另外,利用凯氏定氮法对板蓝根、南板蓝根和大青叶的生药和相应的新鲜植物组织中的总蛋白含量进行测定,提取液中的蛋白质组分应用SDS2PAGE电泳进行分析,证实了三种药材的蛋白质种类和含量有一定差别,且同种药材的新鲜植物组织和生药蛋白质组分在含量和种类上有明显差别[20]。
7 结束语
总之,虽然蛋白质含量的测定方法很多,但是,还没有一个完美的测定中药材中蛋白质含量的方法。在选择方法时应考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度;中药材中蛋白质的性质;中药材中存在的干扰物质;测定所要花费的时间等各种因素。在选择测定方法时,可根据实验要求和实验室条件决定,从而选出适合且误差较小较准确的方法。
, 百拇医药
参考文献
[1] 赵英永,戴云,崔秀明,等.考马斯亮蓝 G250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量. 云南民族大学学报(自然科学版), 2006,15(3):235.
[2] 李建武 ,萧能愿 ,余瑞元,等. 生物化学实验原理和方法 .北京大学出版社,1994: 160176.
[3] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantifies of protein utilizing the principle of protein dye binding.Anal Biochem,1976,7(72):248254.
[4] 曲春香,沈颂东,王雪峰,等. 用考马斯亮蓝测定植物粗提液中可溶性蛋白质含量方法的研究 . 苏州大学学报(自然科学版),2006,22(2):82.
, 百拇医药
[5] 汪良驹 ,姜卫兵,祝海阔,等. 银杏叶片可溶性蛋白质测定非直线性原因分析.果树学报,2002,19(1):32.
[6] 回瑞华,侯冬岩,李学成,等.荞麦中蛋白质含量的分析.食品科学,2004,25(10):230232.
[7] 郭颖娜,孙卫. 蛋白质含量测定方法的比较.河北化工,2008,31(4):3637.
[8] 周燕,薄或坤,王玉华. 八味沉香胶囊中总蛋白质的含量测定. 内蒙古医学院学报,2007,29(6):426430.
[9] 韩定献,周军,徐辉碧. 天力保胶囊中蛋白质和氨基酸的含量测定.中成药,2005,27(2):224225.
[10] 景小琦,武雪芬,雷敬卫.金银花枝叶中粗黄酮、无机元素和蛋白质含量测定. 河南中医,2001,21(4):6667.
, 百拇医药
[11] 杨玉芳. 蛋白质含量测定方法.明胶科学与技术,2007,27(2):99.
[12] 刘训红,王玉玺.决明子中营养成分分析.时珍国医国药,2000,11(10):865866.
[13] 薛志欣,杨桂朋,马晓梅,等. 分光光度法测定藻胆蛋白含量的研究.鲁东大学学报(自然科学版),2008,24(3):250253.
[14] 康东周,张善玉,全仙花. Lowry 法测定宫颈癌片中蛋白质的含量.现代医药卫生,2005,21(23):32103211.
[15] 吴瑾瑾,石森林. FolinLowry法测定康克胶囊可溶性蛋白质含量.浙江中医学院学报,2001,25(5):75.
[16] 陈颖,王赛贞,林树钱.用Folin酚法测定灵芝产品中多糖肽含量. 海峡药学,2007,19(7):3739.
[17] 陈毓荃.生物化学实验方法和技术.科学出版社,2002:8.
[18] 曹艳,黄必胜.半夏总蛋白含量的紫外吸收法测定. 湖北中医杂志,2005,27(7):48.
[19] 唐任能,赵雨,孙晓迪,等. 梅花鹿鹿茸、鹿托盘及鹿骨水溶性总蛋白比较研究. 吉林中医药,2008,28(4):295296.
[20] 项雷文 ,高观祯,汪惠勤,等. 板蓝根、南板蓝根及大青叶中蛋白质组分分析.中药材,31(3):390392., 百拇医药(张善玉 葛 娜)