乌司他丁对脓毒症大鼠肺微血管通透性及肺组织VEGF表达的影响(2)
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1.4 检测肺组织VEGF mRNA表达 采用RT- PCR技术检测。取肺组织100 mg置碾钵中用液氮制备肺组织匀浆,采用Trizol(Sigma公司)一步法提取肺组织总RNA。采用两步法RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)进行RT-PCR, 以GAPDH作为内参照,以10μl扩增产物经质量分数115%琼脂糖凝胶电泳后,用LabWork 410 UVP成像系统照相并分析结果。以目的基因与内参照在凝胶上的灰度值比值为基因表达的相对含量。大鼠VEGF序列(扩增片段为578bp):上游5′-ATG AAC TTT CTG CTG TCT TG-3′,下游5′-TCA CCG CCT CGG CTT GTC A-3′;大鼠GAPDH系列(扩增片段500bp):上游5′-TCC ATG ACA ACT TTG GTA TCG T-3′;下游5′-GTG GGC CAT GAG GTC CAC-3′。PCR反应条件: 94℃ 5 min预变性, 94℃ 40s变性, 56℃ 45 s退火, 72℃ 55 s延伸,共计32个循环, 72℃ 10 min延伸。RT-PCR操作严格按照说明书进行。
1.5 测肺组织VEGF蛋白表达 采用ELISA法检测。严格按照大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒(武汉中美科技有限公司)说明书操作,酶标仪(BIO-RAD680)波长450 nm下读取吸光度,根据标准曲线得出VEGF浓度。
1.6 肺微血管通透性的测定 ①伊文思蓝含量测定法:按20 mg/kg经左侧颈外静脉注射2%伊文思蓝液(北京恒业中远化工有限公司),半小时后将动物麻醉开胸取部分左肺,剪去周围组织,吸干表面水分及血液,称量湿质量,将肺组织剪成约10 mm3小块浸泡于甲酰胺溶液中(0.2 g/Kg),置60℃恒温水浴中抽提24 h,待组织中色素全部浸出,取出组织,离心,取上清液,在与标准曲线相同的条件下,用紫外分光光度计(岛津2000)在620nm波长处进行比色测定光密度值,在标准曲线上查出EB含量,以每克肺组织干重含EB质量表示;②湿/干质量比测定:称肺组织湿质量后,置烤箱80℃,72 h,称干质量,计算湿/干质量比值。
1.7 统计学方法 采用SAS v8.1统计软件包对所得资料进行统计分析。计量资料采用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况观察 B组大鼠术后2 h活动度即明显下降,并逐渐表现出厌食、竖毛、眼球下陷、呼吸急促、对外界刺激反应淡漠等。腹腔肠系膜充血、肠管显著扩张、被结扎盲肠坏死、血性腹水、病灶处大网膜包裹不佳、肝肿大、肺充血明显。C组亦有厌食、竖毛、活动度减少等情况,但明显较B组轻微,且C组肠管仅轻度扩张,腹水减少,坏死盲肠被大网膜及周围肠管包裹明显。A组没有相关表现。
2.2 大鼠肺组织VEGF mRNA表达 B组明显高于A、C组,C组高于A组(P<0.05),见表1。
2.3 大鼠肺组织VEGF蛋白表达 B组明显高于A、C组,C组高于A组(P<0.05),见表1。
2.4 肺组织EB含量 B组明显高于A、C组,C组高于A组(P<0.05),见表1。
2.5 肺组织湿/干质量比 B组明显高于A、C组,C组高于A组(P<0.05),见表1。
3 讨论
脓毒症主要表现为系统炎症和器官功能损害,而微血管通透性增高是器官功能受损的重要特征之一。血管通透性增高,一方面使大量液体渗入组织间隙,增加毛细血管与细胞间的距离,加重组织细胞的缺氧;另一方面还使炎症细胞过多聚集于局部组织,通过释放蛋白酶及氧自由基等,直接造成组织细胞的损伤[1]。
国外学者的研究显示,组织的缺血缺氧可使组织血管内皮生长因子(VEGF)表达增强[2]。VEGF是一种特异地作用于血管内皮细胞的生长因子,广泛分布于人和动物体内的脑、心(尤其是心肌细胞)、肾、肝、脾、肺、胃、眼等许多组织和细胞中[3],是目前已知的最强烈的血管渗透剂,在1 mmol/L 浓度下即有活性,其活性是组胺的5000倍[4],特别是对毛细血管后静脉和小静脉的通透性,它增加血管通透性的作用不能被抗组胺方法或其他一些炎症抑制因子所阻断。肺是体内VEGF的最大的来源, VEGF在肺内主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞表达[5],实验证实VEGF在肺内被严格的区域化,人的肺泡毛细血管膜上皮侧液体中VEGF的浓度是血浆的500倍[6]。肺是VEGF生理性的水池,VEGF可能是一把锋利的双刃剑,当紧密的上皮屏障被破坏时,VEGF会带来巨大的破坏作用导致肺水肿。
乌司他丁注射液是从人尿中提取的一种具有广谱蛋白酶抑制作用的糖蛋白,研究证实它可以有效抑制脓毒症向多器官功能障碍综合征(MODS)转化,可有效降低脓毒症患者的死亡率[7],国内外目前并未见有关乌司他丁对脓毒症血管通透性影响的报道。本研究通过向脓毒症大鼠颈外静脉内注射伊文思蓝测定肺组织对这种染料的通透性,证实乌司他丁可以阻止大鼠微血管通透性增高的推测,进一步了解乌司他丁治疗脓毒症的作用机制。
本研究发现外源性给予乌司他丁后,大鼠微血管通透性明显降低,同时亦检测到大鼠肺组织VEGF的表达较CLP组明显降低。笔者推测乌司他丁可能通过抑制大鼠肺组织VEGF的表达降低大鼠微血管通透性,从而起到肺保护作用。这与国外相关研究[8,9]表明在脓毒症患者血清中血管内皮细胞生长因子(VEGF)浓度显著升高,VEGF可使血管通透性增加是一致的。当然对于脓毒症发生及发展过程肺组织VEGF表达的动态变化以及乌司他丁作用的时间依赖性还有待于进一步深入研究。
参 考 文 献
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