ERK信号转导途径在小檗碱抑制脂多糖诱导的COX-2表达中的作用(2)
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1 对象与方法
1.1 对象 取6名健康捐献者外周静脉血各25 ml,并按下述实验方法进行分组研究。
1.2 检测方法
1.2.1 人外周血单核细胞分离及培养
人外周血单核细胞分离与鉴定取正常健康捐献者外周静脉血25 ml,肝素抗凝,按常规方法用淋巴细胞分离液(北京鼎国生物技术公司)分离出外周血单个核细胞,充分洗涤,以含10%FCS的RPMI1640培养液(美国Invitrogen公司)重悬细胞,以5×109 cells/L的密度接种培养。贴壁细胞经瑞氏染色,油镜下观察细胞形态,非特异性酯酶染色氟化钠抑制实验以及抗CD68细胞免疫化学染色等方法鉴定。台盼蓝排斥实验示细胞存活率为98%后将所得PBMC均匀接种于24孔培养板,每孔细胞数约为5×106(0.5 ml)。
1.2.2 实验分组 ①对照组;②LPS组:予以LPS10 μg/ml刺激;③ LPS+小檗碱25 μmol/L组;④ LPS+小檗碱50 μmol/L组;⑤ LPS+小檗碱100 μmol/L组。以不同浓度小檗碱预处理2 h,再以LPS刺激,培养24 h。
1.2.3 ERK1/2总水平、磷酸化水平及活性测定,COX-2蛋白水平测定:于实验开始30 min, 6 h, 12 h, 24 h时收集细胞,加入细胞裂解液(20 mM Tris(pH 7.5),150 mM NaCl,1% Triton X-100,以及sodium pyrophosphate,β-glycerophosphate,EDTA,Na3VO4,leupeptin,PMSF),数分钟后,10 000~14 000 g离心3~5 min,取上清,以BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物公司)测定蛋白浓度,按照每4 μl蛋白样品加入1 μl蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X) ......
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