STAT3-siRNA对人甲状腺癌SW579细胞株增殖侵袭的影响(2)
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1.2.2 RT-PCR SW579细胞(5×105)接种于6孔板中,转染48 h后用Trizol试剂提取总RNA,用两步法RT-PCR试剂盒进行逆转录反应,反应体系中各加入两对引物,第1对为人STAT3基因引物,上游:5′-ATTCGGGAAGTATTGTCG-3′;下游:5′-GCCTCAGTCGTATCTTTC-3′。第2对引物为人β-actin基因引物,上游:5′-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3′;下游:5′-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3′。反应条件:94℃ 3 min,循环条件:94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min,×30个循环;最后在72℃延伸10 min。RT-PCR产物在用EB染色的琼脂糖凝胶中观察。根据以下公式计算mRNA表达抑制率:抑制率(%)=1-(对照组平均相对灰度值/实验组平均相对灰度值)×100%。
1.2.3 Western blotting 检测SW579细胞(5×105) 接种于6孔板中,转染72 h后,收集细胞,并用冰PBS洗2遍,每孔细胞用lysis buffer 50 μl,等量蛋白(40 μg)在15 %SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离,并电转至销酸纤维素膜,然后用以TBS溶解的5 %的脱脂奶粉在室温封闭1 h,用兔抗人STAT3抗体(稀释至1∶500) 4℃孵育过夜,再用含0.1%吐温20的TBS洗液洗3遍,将膜与羊抗兔二抗孵育,以辣根过氧化物酶介导的化学发光法检测结果。同时膜还要与1∶1000稀释的抗β-actin 抗体孵育,最后用凝胶成像系统分析结果。根据以下公式计算蛋白表达抑制率:抑制率(%)=1-(对照组平均相对灰度值/实验组平均相对灰度值) ×100%。
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