EGFR与CK20 mRNA在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义(2)
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1.2.3 总RNA提取 按RNA抽提操作手册(大连宝生物工程公司)的方法提取组织总 RNA。提取的RNA 经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,通过紫外分光光度计测定260 nm与280 nm吸光度值而计算RNA的纯度与浓度。
1.2.4 逆转录反应,cDNA的合成 反应体系:dNTP Mixture 1ul,Template RNA 1 μg, RNase Free dH2O至10ul,65℃孵育5 min后置于冰上,加入5×Prime Script Buffer 4 μl, RNase Inhibitor 0.5 μl, Prime Script RTase 0.5ul,RNase Free dH2O 5ul, 30℃10 min,42℃20 min,95℃5 min后置于冰上。逆转录出的cDNA用于PCR反应或于-20℃保存备用。
1.2. 5 聚合酶链式反应 取上述逆转录反应液2 μl,加入10×PCR Buffer 2 μl,dNTP Mixture 0.8 μl,TaKaRaExTaqHS 0.2 μl,上下游引物各1 μl,RNase Free dH2O 13 μl。CK20反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,63℃退火1 min,72℃延伸30 s,循环35次。EGFR和GAPDH反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min。反应产物取10 μl行2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶染色,紫外光下照相记录。
1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。率的比较采用χ2检验和Fisher精确概率法, EGFR、CK20表达的相关性用非参数Spearman等级相关处理。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
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