甲泼尼松对兔急性脊髓损伤后MMP-2\12表达及神经功能的影响(2)
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1.5.2 实施荧光定量PCR 按照试剂盒说明操作,①通过逆转录将样品RNA转变为cDNA;②制备标准曲线样品:进行相对定量,需要将样品的目的基因及管家基因进行PCR 扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线;③将标准曲线样品与待测样品分别假入到Real-Time PCR反应液中,进行Real-Time PCR 扩增与检测;④检测结果进行标准曲线分析。
1.6 HE染色病理学观察 对假手术组及损伤组在损伤后按时间点进行脊髓取材,取材部位应在打击中央,以4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,4 μm连续切片,将做好的切片按以下顺序脱蜡:(1)二甲苯(2～3 min)→二甲苯(2～3 min)→二甲苯(2～3 min);脱过蜡的切片再按以下顺序用乙醇洗去二甲苯:无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水;(2)苏木素中浸泡5 min,用蒸馏水冲洗,放入盐酸乙醇中浸泡20 s,用蒸馏水冲洗,再放入蒸馏水中浸泡15 min;(3)伊红染色1 min,依次在75%、80%、95%及无水乙醇中浸泡1 min。用中性树脂封片,晾干。
1.7 改良Tarlov评分法实验动物在术前1 h,术后麻醉清醒后6 h,损伤后24 h,48 h、7、14 d各组取5只放于开阔空间内观察动物双后肢运动功能。(采用改良Tarlov评分法,标准为:0分:完全瘫痪,针刺下肢无反应。1分:完全瘫痪,针刺下肢有反应,但肢体不能活动。2分:肢体可活动,但不能站立或站立不稳。3分:可站立,但无法行走。4分:可行走数步,但不能稳定。5分:能缓慢行走,但不灵活。6分:正常行走。)
1.8 统计学方法 SPSS 12.0软件进行统计分析,血清中MMP-2、12含量及组织PCR 荧光定量CT值与细胞阳性表达率采用两样本t检验或t’检验,设α=0 ......
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