解毒通络调肝散对实验性糖尿病大鼠肝脏IRS-2表达的影响(1)
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【摘要】 目的 观察解毒通络调肝散对糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠肝脏IRS 2的影响。方法 采用高脂饮食加链脲佐菌素诱导糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、吡咯列酮组和解毒通络调肝组。给药8周后进行各指标检测。结果 解毒通络调肝散能升高糖尿病胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性指数,增加实验性糖尿病(DM)大鼠肝脏组织IRS 2的表达。结论 解毒通络调肝散对大鼠IR有显著的改善作用,其机制可能与增加实验性糖尿病(DM)大鼠肝组织中IRS 2表达有关。
【关键词】 胰岛素抵抗;解毒通络调肝散;IRS 2
胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的重要发病机制之一,其具体的病理基础较为复杂。在临床中应用解毒通络调肝法可改善2型糖尿病患者IR状态,并且我们的前期实验研究工作也表明[1],解毒通络调肝散具有改善实验动物IR的作用,为进一步探讨其改善IR的作用机理,本实验观察了解毒通络调肝散对实验性DM大鼠肝组织单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)及胰岛素底物2(IRS 2)表达的影响,探讨二者与T2DM、IR之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及饲料 清洁级8周龄雄性Wistar大鼠60只(体重150~170 g),购于吉林大学基础医学院,基础饲料(热量15 J/g)由吉林大学实验动物中心提供,高脂饲料由吉林大学实验动物中心新鲜配制:基础饲料63%,15%牛油,20%蔗糖,2%胆固醇,提供热量约20 J/g,其中脂肪提供热量占总热量30%。
1.2 药物及试剂 解毒通络调肝散:长春中医药大学附属医院中医研究所提供;盐酸二甲双胍肠溶胶囊(君力达):北京圣永制药有限公司;盐酸吡格列酮片(瑞彤):江苏恒瑞医药股份有限公司。链脲佐菌素(STZ):美国Sigma公司;末端全血葡萄糖测试条:北京怡成生物电子技术有限公司;兔抗大鼠IRS 2的多克隆抗体,北京博奥森生物技术有限公司。
1.3 动物分组及处理 60只大鼠按体重随机分为2组,正常对照组8只,DM模型制作组52只。正常对照组给予基础饲料,造模组给予高热量饲料。4周后,造模组腹腔注射1.2%STZ溶液30 mg/kg。于注射STZ1周后测定糖耐量。按照国际通用大鼠糖尿病诊断标准:血糖峰值>16.8 mmol/L和120 min血糖>11.1 mmol/L为糖尿病,具备上述一条为糖耐量减低[2]。取糖尿病或糖耐量减低造模组动物为实验对象。将造模成功大鼠48只按血糖峰值分层,随机分为模型组(n=12),中药组(n=12),二甲双胍组(n=12),吡格列酮组(n=12)。三个治疗组分别每日定时灌服解毒通络调肝散悬混液5 g/(kg•d)、二甲双胍水溶液0.5 g/(kg•d)、吡格列酮悬混液5 g/(kg•d),动物自由进食饮水,正常对照组喂普通饲料,其他组喂高热量饲料。治疗周期为8周。治疗结束时,纳入统计数据的动物数为:正常对照组8只,模型组8只,二甲双胍组9只,吡格列酮组10只,中药组10只。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 生化指标的检测 血糖:怡成血糖仪检测;血清胰岛素:磁酶免分析仪I(美国Bio Rad)检测;胰岛素敏感指数ISI:Ln(1/空腹血糖×空腹胰岛素)。
1.4.2 肝组织MCP 1、IRS 2蛋白表达测定 采用免疫组织化学SP法检测。一抗分别为兔抗大鼠MCP 1多抗(工作浓度:1:100)、兔抗大鼠IRS 2多抗(工作浓度1:200),二抗为山羊抗兔IgG。生物素标记来自抗兔的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素SP试剂盒。严格按试剂盒说明书进行。
1.4.3 肝组织MCP 1、IRS 2蛋白免疫组化染色半定量评分标准 所有切片均由有经验的病理科医师盲法阅片作出诊断,每张切片观察5个×400视野。MCP 1以胞膜和胞浆核棕染为阳性,IRS 2以胞浆棕染为阳性。结果评定标准:着色程度:不着色者为0分,着色淡者为1分,中等着色为2分,着色深者为3分。着色细胞阳性范围:无着色0分,着色阳性细胞小于1/3为1分,着色阳性细胞1/3～1/2为2分,着色阳性细胞大于1/2为3分。将每张切片着色程度与着色细胞阳性范围得分各自相加为其最后计分。
1.4.4 肝组织IRS 2 mRNA表达的测定 按Trizol试剂说明书操作。根据文献[3]合成IRS 2寡核苷酸(PCR)引物。IRS 2引物序列:上游 5’ GCA GTT CAG GTC GCC TCT GC 3’;
下游 5’ GGA GCC ACA CCA CAT TCG CA 3’;GAPDH引物序列:上游 5’ ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3’;下游5’ TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA3’;引物由北京鼎国生物技术发展公司合成。扩增条件为:94℃预变性2 min后进入如下循环:94℃→45s,55℃→45 s,72℃→45s,循环数为30个,最后于72℃延伸10 min。扩增的IRS 2长度为416 bp,GAPDH长度为450bp。用凝胶成像分析系统进行紫外光成像和图形分析,以GAPDH密度作为参考定量标准,数值以两者之吸光度(Int)×面积(Pix)比值表示,以对照组的比值作为标准1.0,计算IRS 2基因相对表达量。
1.5 统计学处理 数据以(x±s)表示,采用SPSS 13.0软件进行方差分析检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素敏感指数(Ln)比较 大鼠饲养4周时,造模组大鼠平均空腹血糖显著高于正常组(P<0.01),但未达到糖尿病诊断标准。注射STZ后大鼠空腹血糖、1 h血糖及2 h血糖水平明显升高。12周末,治疗组大鼠血糖较模型组明显降低(P<0 ......
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