前列腺特异膜抗原及其变异体DNA检测在临床应用初探(2)
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1.2.2 构建PC3.0-T-PSMAcDNA 质粒和PC3.0-T-PSMA5cDNA质粒作为标准品:碱裂解法提取质粒pcDNA3.0,用BamHI和XhoI双酶切质粒和PCR产物,各自回收纯化后用T4连接酶连接。将PC3.0-T-PSMAcDNA质粒和PC3.0-T-PSMA5cDNA质粒用10倍梯度稀释法得到系列浓度的标准品。
1.2.3 反应体系 cDNA 1 μl,H2O 8 μl,Forward primer(50μM)0.2 μl,Reverse primer(50μM)0.2 μl,MASTER MIX(2X)10 μl,总的反应体系共20 μl。其中试剂盒配套MASTER MIX(2X)是各种试剂的混合液,其中包括RNase Free dH2O、Buffer、各种酶等。
1.2.4 样品检测 每次检测均加入一空白管作一阴性对照,每个样品通过PCR 反应得到各自的Ct 值,样品测得Ct 值后,仪器自动绘出标准曲线并给出初始拷贝数。
2 结果
PT、P及P53对引物在外周血细胞和血浆中对PSMA总、PSMA和PSMA5 DNA的定量扩增结果,见下表。
表1
PT、P及P5在外周血细胞和血浆中对PSMA总、PSMA和PSMA5 DNA的定量扩增结果(×106copies/μg)
PSMA总DNAPSMA DNAPSMA5 DNA
血细胞血浆血细胞血浆血细胞血浆
前列腺癌1.32±0.5602.15±1.3302993.65±2112.10
前列腺增生0.279±0.22010.9±3.45000
正常对照0.3±0.1200.3±0.1800.1±0.090
3 讨论
实验过程中我们用PT、P及P5这三对引物分别对前列腺癌LNCap细胞进行RT-PCR试验。三种引物各自的扩增产物长度经电泳证明,分别与设计引物时所预测的长度相吻合;内参GAPDH也能很好的从LNCap细胞上扩增出来,而阴性对照蒸馏水经定量PCR是没有扩增产物的[3]。该结果表明该方法符合我们设计初衷。
已往的研究认为PSMA是前列腺癌较好的肿瘤相关抗原,它在正常、增生、原发性前列腺癌及其转移灶中以及肿瘤新生血管中均有表达,且高水平的PSMA表达与肿瘤的侵袭力有关[4]。我们在研究中发现PSMA与PSMA5在正常前列腺组织中的平均表达量为0.94×103copies/μl和0.4×103copies/μl。在增生前列腺组织中PSMA和PSMA5的平均表达量为2.22×103copies/μl和10.87×103copies/μl。PSMA5 DNA在多个病例组织中被检测到,证实了该变异体的存在不是个别的基因突变现象,而是一个广泛存在的基因调控的可变剪接结果[5]。此外,正常组织与病变前列腺组织中PSMA5 DNA的检测结果具有明显差异,与PSMA不同,后者在所有前列腺上皮组织中均有检测。提示PSMA5具有更高的前列腺病变组织特异性,与前列腺组织的病变密切相关。在临床上具有辅助诊断的应用价值,有望成为前列腺癌生物治疗的靶点。本研究首次将PSMA5的定量分析引入前列腺癌的诊断研究,发现其有着优于PSMA的组织特异性和病变特异性,但两者作为前列腺癌的生物学标志物,如能将其综合互补应用在临床诊断前列腺癌,相信将大大提高前列腺癌的检出率及正确率。同时,此方法相对于病理学诊断具有无创、快速、简便、易标化等优点,更适于在定量水平对患者进行动态的观察,对术后随访及疗效评价都是一个有益的探索。
参考文献
[1] Cao KY,Mao XP,Wang DH,et al.High expression of PSM-E correlated with tumor grade in prostate cancer:a new alternatively spliced variant of prostate-specific membrane antigen ......
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