奥曲肽联合顺铂对人胃癌细胞株MGC803生长影响的研究(1)
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【摘要】 目的 研究奥曲肽联合顺铂对人胃癌细胞株MGC803增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法 利用不同浓度的奥曲肽、顺铂以及一定浓度的奥曲肽联合顺铂作用于体外培养的人胃癌细胞株MGC803，应用MTT 法分析细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率。 结果 奥曲肽及顺铂对MGC803细胞的生长增殖产生抑制作用，并具有量效、时效及饱和性；大多数细胞被阻滞于G0/G1期，S期和G2/M期细胞数明显减少，细胞分裂受到抑制，凋亡率增加。结论 奥曲肽联合顺铂抑瘤率及细胞凋亡率显著高于单用奥曲肽或顺铂治疗组，表明奥曲肽和顺铂有协同作用，这为临床奥曲肽联合顺铂治疗胃癌提供了理论基础。
【关键词】 奥曲肽；顺铂；胃癌细胞株；细胞凋亡
奥曲肽是人工合成的一种生长抑素类似物，广泛应用于上消化道出血、急性胰腺炎及肠瘘等多种疾病的治疗。近年来，生长抑素类似物对肿瘤增殖的抑制作用日益受到关注[1]。国内外研究表明，奥曲肽不仅对绝大多数具有神经内分泌功能的肿瘤有肯定疗效，对一些实体肿瘤亦有抑制肿瘤细胞增生，减缓肿瘤的生长速度，诱导细胞凋亡等作用[24]。顺铂是目前胃癌化疗方案中的基础用药。为了进一步了解奥曲肽对胃癌细胞生长的影响，探讨其治疗胃癌的可能性，我们选用低分化人胃癌细胞株MGC803，观察其对胃癌细胞生长增殖、凋亡的影响，以期为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 人胃癌细胞株MGC803购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心，奥曲肽购自北京诺华制药有限公司，购自旭东海普药业有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)及碘化丙啶(PI)均购自Sigma公司，RPMI1640培养基购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司。
1.2 细胞培养与分组 人胃癌细胞株MGC803在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下常规培养、传代保种。对照组为含细胞培养液，实验组分奥曲肽处理组(100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L))、顺铂处理组(0.2 μg/、2 μg/L、20 μg/L)、联合处理组(奥曲肽200 μg/L+顺铂2 μg/L)。
1.3 细胞增殖实验(MTT法) 取状态良好的处于对数生长期的MGC803细胞，用含15%胎牛血清的1640培养液配成5.0×104/ml细胞悬液，接种细胞于96孔培养板中，置37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，48 h后弃去培养液，重新加入含8%胎牛血清的培养液继续培养12 h，并加入不同浓度的奥曲肽、顺铂，使实验组奥曲肽浓度依次为100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，顺铂浓度分别为0.2 μg/L、2 μg/L、20 μg/L，奥曲肽联合顺铂浓度分别为200 μg/L和2 μg/L，阴性对照组为不含奥曲肽或顺铂的200 μl含细胞培养液。每浓度设3个复孔，各组分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔用5 mg/mlMTT溶液20 μl,37℃温浴4 h，离心后吸出上清液，每孔加入200 μl二甲亚砜(DMSSO)以中止反应,平板振荡器振荡至结晶完全溶解后；用自动酶标仪在波长492 nm处测定每个小孔的光密度值(OD值)，以OD 值间接反应存活细胞数量,并将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体外抑瘤率，按公式：抑瘤率(%)=(1实验组OD值/对照组OD值)×100%计算抑制率。
1.4 流式细胞仪测定 选择处于对数生长期的MGC803细胞，用含15%胎牛血清的1640培养液配成1×105/ml的单细胞悬液，接种于6孔培养板。实验分组：对照组、奥曲肽组(200 μg/L)、顺铂组(2 μg/L)、联合处理组(奥曲肽200 μg/L+顺铂2 μg/L)。作用48 h后，用0.25%胰酶、0.02%EDTA消化，收集用药组和对照组细胞，70%冷乙醇固定24 h，离心去乙醇，加入10 ul Rnase(50 ug/ml)37℃孵育30 min后，加10 μl碘化丙啶(PI，50 ug/ml)4℃暗处作用20 min，用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测，软件分析细胞凋亡率。
1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件，数据用均数±标准差(x±s)表示，结果比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 奥曲肽在不同时间、浓度对胃癌MGC803细胞增殖的影响 不同浓度的奥曲肽在不同时间与对照组相比，其抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05)，随着奥曲肽浓度的增加和作用时间的延长，抑瘤作用逐渐增强，结果见表1。但奥曲肽浓度的增加一定后，其抑瘤率不再增加，奥曲肽在不同时间点，当浓度为400 μg/L时，其抑瘤率与200 μg/L相比，差异无统计学意义(P>0.05)。奥曲肽在三个不同的浓度时，24 h和48 h两组抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05)，48 h与72 h组间抑瘤率尽管有增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 顺铂在不同时间、浓度对胃癌MGC803细胞增殖的影响 与对照组相比，不同时间及不同浓度的顺铂其抑瘤率显著增高(P<0.05)，见表2。顺铂随着浓度的增加，其在不同时间抑瘤率皆增加，但当顺铂浓度为20 μg/L时，其抑瘤率与浓度2 μg/L时抑瘤率差异无统计学意义(P>0.05)。 顺铂随着时间的延长，抑瘤率增加，24 h和48 h两组抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05)，48 h与72 h组间抑瘤率的差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 奥曲肽联合顺铂对胃癌细胞MGC803增殖的影响
根据以上的实验结果，在奥曲肽联合顺铂实验中，选用奥曲肽和顺铂浓度分别为200 μg/L和2 μg/L，作用的时间为48 h。与对照组相比，奥曲肽治疗组、顺铂治疗组及奥曲肽组联合顺铂组抑瘤率显著增高(P<0.05)。奥曲肽联合顺铂抑瘤率显著高于单用奥曲肽组和顺铂组(P<0.05)，见表3。
2.4 奥曲肽、顺铂、奥曲肽联合顺铂对胃癌细胞凋亡的影响 MGC803细胞分别经200 μg/L的奥曲肽、2 μg/L的顺铂及奥曲肽联合顺铂处理48 h后，经流式细胞仪检测，细胞大多数被阻滞于G0/G1期，S期和G2/M期细胞数明显减少，细胞分裂受到抑制，凋亡率增加。对照组未见到明显的亚二倍体峰，各实验组均检测到典型的亚二倍体峰，各实验组凋亡率与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组的凋亡率显著高于单用奥曲肽或顺铂组(P<0.05)，见表4。
3 讨论
生长抑素及其类似物不仅能够抑制多种激素及生长因子及其对对靶细胞的作用 ......
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