脊髓继发性损伤大鼠脊髓前角5羟色胺阳性细胞的变化研究
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【摘要】 目的 观察继发性脊髓损伤大鼠5羟色胺阳性反应物的变化。方法 用组织化学和图象分析方法观察大鼠脊髓前角运动神经原内5羟色胺细胞的变化。结果 继发性脊髓损伤大鼠脊髓前角运动神经原5羟色胺细胞免疫反应减弱(P<0.01)。结论 5羟色胺阳性反应物减少这可能与继发性脊髓损伤发生变化有关。
【关键词】 继发性脊髓损伤；5羟色胺；大鼠
Effect of athletics on 5HT in secondary spinal cord injury
FENG Li,LI Ke,ZHANG Hui.Liaoning Health College of Vocational Technology,Shen Yang 110101,China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between changes of 5HT in secondary spinal cord injury of rats.Methods The alteration of 5HT and ultrastructure of anterior horn neurous were studied by means of histochemistry and quantitative method of microimage analysis system were observed morphine dependence rats.Results The average grey value of5HT positive reactive product in experimental group was lower than that in control group(ph<0.01).Conclusion The alteration of 5HT is concerned with secondary spinal cord injury.
【Key words】 secondary spinal cord injury；5HT；Rat
急性脊髓损伤后开始时常为不完全性，最后结果常为两种损害机制引起：原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤(SSCI)。继发性脊髓损伤为伤后几小时至几天发生的一系列损伤激活的自身破坏过程，使最初病灶周围原来完整的组织发生自身破坏性病变，周围神经功能损害逐渐发展。所产生的脊髓损害远远超过了原发性损伤[1]。
单胺类递质是指多巴胺、去甲肾上腺素和5羟色胺(5Hydroxyptamine,5HT)。由于动物实验中采用了荧光组织化学方法，目前对中枢内单胺类递质系统了解得比较清楚。
脑内5羟色胺主要来自中缝核上部，破坏中缝核上部可使脑内5羟色胺含量明显降低。下行部分的神经元位于中缝核下部，其神经纤维下达脊髓背角的胶质区、侧角和前角。
我们观察继发性脊髓损伤后大鼠脊髓前角内神经5羟色胺阳性反映物改变，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料 雄性Wistar大鼠 中国医科大学动物室提供,5HT 试剂盒(购于Sigma公司)； LUZEXF显微图像分析仪(日本，松下公司)。
1.2 实验动物分组 本实验选用雄性健康Wistar大鼠40
只，体重260~300 g，随机分成两组。正常对照组：20只。实验组：20只。
1.3 实验方法
1.3.1 继发性脊髓损伤大鼠模型制备 1%戊巴比妥钠腹腔麻醉动物(30 mg/kg)，俯卧位固定于立体定位仪上。以T10为中心暴露上下位椎板，咬除椎板，保持硬脊膜完整。在T10阶段节段脊髓表面垫一曲度与脊髓表面一致的3 mm×8 mm塑料片，用30 g重物垂直压迫T10节段脊髓10 min，逐层缝合肌肉皮肤。符合以下条件的大鼠归入损伤组：压迫时身体痉挛性颤动、尾巴痉挛性摆动、双下肢及躯体回缩样扑动；压迫后硬脊膜内充血或水肿，双下肢呈迟缓性瘫痪，斜板实验测定最大角度<30°。对照组大鼠只暴露脊髓。术后不同时间点处死动物，4%多聚甲醛灌注固定，无菌条件下取损伤节段脊髓组织约1.0 cm，液氮保存或石蜡包埋。观察期间大鼠如有死亡即时补足。
1.3.2 组化标本制备
对实验动物用1%戊巴比妥钠(40 ml/kg)腹腔麻醉后开胸，经左心室70滴/min滴入1%肝素钠的生理盐水500 ml，同时剪开右心耳。继用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出实验动物的脊髓组织，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中进行后固定大约2 h，之后将实验动物的脊髓组织切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至组织薄片沉底，经水包埋，恒冷箱连续横切片，片厚20μm。经OCT包埋，恒冷箱连续切片，片厚16 μm，70℃保存备用。
1.3.3 尼氏染色 冰冻切片吹干，经PBS漂洗5 min×3次，将切片置入1%甲苯胺蓝溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸馏水冲洗，PBS漂洗5 min×3次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。
1.3.4 5HT染色方法 ①冰冻切片吹干，PBS冲洗5 min×3次;
②1:50正常羊血清中孵育30 min;
③倾去血清，加入兔抗5HT抗体(1:4000)，4℃过夜;
④PBS冲洗5 min×3次;⑤滴加生物素化抗兔抗体(二抗)1:40稀释，室温孵育60 min;
⑥PBS冲洗5 min×3次;⑦滴加HRP标记的卵白素1:40稀释，室温孵育60 min;
⑧PBS冲洗5 min×3次;
⑨DAB成色5 min;⑩PBS冲洗5 min×3次;
B11梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察;
B12对照实验在邻近切片上进行，用抗原吸收后的一抗代替一抗，结果为阴性。
1.4 显微图像定量分析 用LuzexF显微图像分析仪测定脊髓前角单位面积5HT阳性反应物平均灰度值和阳性反应物密度，所得数据经计算机SAS软件系统进行统计学处理，用(x±s)表示，计量资料采用t检验。
2 结果
2.1 尼氏染色结果 正常对照组大鼠脊髓前角细胞的尼氏染色切片上，神经元数量较多，排列紧密，形态完整，细胞浆有内尼氏体。
实验组大鼠脊髓，肉眼可见大鼠脊髓损伤局部组织充血。镜下可见SCCI后3~6 h损伤局部神经元核固缩，胞体缩小，胞质深伊红染色，成为红色是神经元。伤后1~3 d，轴突肿胀，出现空泡，白质内神经髓鞘散乱、崩解破裂。伤后3~7 d胶质细胞增生明显，可见卫星现象及鬼影细胞。伤后14 d，损伤段脊髓变细部分灰质崩解坏死 ......
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