土槿皮乙酸对肝癌BEL-7402细胞转移能力的影响
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【摘要】 目的 研究土槿皮乙酸对人肝癌BEL-7402细胞株转移能力的影响。方法 体外培养人肝癌BEL-7402细胞株,用不同浓度PAB及只用培养基(对照组)作用不同时间后,应用MTT法筛选最佳药物浓度。通过Transwell检测PAB对细胞迁移能力的影响。结果 土槿皮乙酸作用后肝癌细胞粘附率较对照组明显下降(P<0.05)，并呈时间和浓度依赖性。土槿皮乙酸作用后迁移细胞数明显低于对照组。结论 土槿皮乙酸能抑制肝癌细胞增殖，降低肝癌细胞转移能力。
【关键词】 土槿皮乙酸；肝癌细胞；增殖；转移
土槿皮乙酸(pseudorlaric acid-B,PAB)是从我国的松科植物金钱松的根皮及近根皮中分离出来的二萜类化合物，为一种单体成分。研究证明PAB可以抑制胃癌[1，2]、肝癌[3]、宫颈癌[4]白血病[5]等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,但尚未发现有关PAB对肝癌侵袭转移作用的报道，本实验将探讨PAB对肝癌细胞转移能力的影响，以为进一步开发治疗肝癌的新药提供试验依据。
1 资料与方法
1.1 细胞株与细胞培养 人肝癌细胞株BEL-7402由中国医科大学附属盛京医院传染科实验室惠赠，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液、饱和湿度,饱和温度为37℃,CO2浓度为5%的培养箱中培养。
1.2 材料 RPMI 1640培养基购自Gibco公司、胎牛血清购自天津灏洋生物制品公司;噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司; 带有8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell细胞培养小室购于美国Costar公司。土槿皮乙酸标准品购自中国药品生物制品检定所,批号:110880。
1.3 MTT比色法检测细胞增殖 收集对数生长期的BEL-7402细胞,接种于用96孔培养板中,每孔100 μl。实验组一组加0.5 μmol/L-1PAB分别培养24、48、72 h,另一组加入不同浓度的PAB使其终浓度分别为4、2、1、0.5 μmol/L,培养24 h。对照组加入100 μl含10%胎牛血清的培养基,于上述培养时间后,加入浓度为5 g/L的MTT 20 μl。继续培养4 h后加DMSO 150 μl,振荡10 min后,用酶联仪于570 nm处测出各孔吸光度值(OD),计算生长抑制率,实验重复3次。生长抑制率=[1-(处理组平均OD值/对照组平均OD值)]×100%。
1.4 Transwell检测 PAB对BEL-7402细胞转移能力的影响
取指数生长期的细胞用于实验，打匀的细胞悬液加入Transwell小室，同时加入0.5 μmol/L-1PAB，我选择的PAB浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50,以血清浓度差作为趋化条件:小室内为含1%血清的培养基，下室为含30%血清的培养基。常规培养24 h后予甲醇固定，姬姆萨染色，取膜，封片，镜检。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件,计量资料以均数(x±s)表示，采用t检验,P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 PAB对BEL-7402细胞增殖的影响 不同浓度PAB(0.5，1.0，2.0，4.0)作用相同时间，随着药物浓度的增加，对细胞生长的抑制率增加，相同浓度PAB作用不同时间(24,48,48 h)，随着时间的增加，对细胞生长的抑制率增加。表现出明显的剂量依赖性和时间依赖性0.5 μmol/LPAB作用24 h，对细胞生长无显著影响。(表1)
表12.2 PAB对BEL-7402细胞转移能力的影响 0.5μmol/LPAB组作用24 h后迁移细胞数明显低于对照组,对照组细胞轮廓清晰,活力旺盛,PAB组细胞明显变圆,稀疏。提示PAB对于肝癌BEL-7402细胞的迁移能力有明显的抑制作用(见图1)。
BEL-7402对照组
0.5 μmol/LPAB处理BEL-7402细胞24 h实验组
图1 Transwell检测 PAB对BEL-7402细胞迁移的影响
3 讨论
土槿乙酸传统上是作为一种抗真菌药物，后来发现其具有抗生育、抗血管生成和抗肿瘤作用。研究证明PAB可以抑制胃癌[1,2]、肺癌、肝癌[3]、宫颈癌[4]白血病[5]等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡，但尚未发现有关PAB对肝癌侵袭转移作用的报道，本实验研究发现土槿皮乙酸作用后肝癌细胞粘附率、转移细胞数较对照组明显下降(P<0.05)，并呈时间和浓度依赖性。土槿皮乙酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响，其作用机制可能与清除氧自由基，作用于细胞周期集细胞周期蛋白依赖性激酶，影响p53、Bcl-2家族、Caspase激活[6]，影响与肿瘤发生密切相关的细胞信号传导通路等有关。
PAB具有明确的抑制血管生成作用，血管内皮生长因子(VEGF)是最具有效性和特异性的诱导血管内皮生成的因子[7],是多种抗肿瘤药物的作用靶点。2004年TanWF等的研究显示PAB可以阻止VEGF诱导的KDR磷酸化,但是并不影响KDR的总蛋白水平。另外PAB也降低了Akt和ERK的磷酸化[8]。土槿皮乙酸有效剂量内并未观察到毒性反应，通过用BALB/C-nu祼鼠进行活体肝肿瘤药敏试验显示:PAB对肿廇的抑制呈剂量依赖性,25 mg/(kg•d)的剂量可以被动物耐受,且没有毒性表现和体质量减轻现象[9]。
综上所述，土槿皮乙酸对肝癌细胞增殖和凋亡[3]确实有影响，本实验发现土槿皮乙酸对肝癌转移能力有抑制作用，但其作用机制还有待进一步研究，以为进一步开发治疗肝癌的新药提供试验依据。
参 考 文 献
[1] 徐永红,王学清,鞠晓华,等.土槿皮乙酸诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡及机制,中国药理学通报，2008，24(5):601-606.
[2] Meng AG,Jiang LL.J Asian Nat Prod Res.Pseudolaric acid B-induced apoptosis through p53-dependent pathway in human gastric carcinoma cells,2009,11(2):142-152 ......
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