大鼠急性脑出血后神经功能保护的实验研究
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基金项目：黑龙江省卫生厅课题(项目编号：2006218)；黑龙江省教育厅课题(项目编号：11541152)
作者单位：150001哈尔滨医科大学附属第四医院(张隽 杨子超)；哈尔滨医科大学附属第二医院(孙威)；佳木斯大学附属第一医院神经内科(王昆祥)
通讯作者：张隽 Email：hljzhangjun@yahoo.com.cn
原花青素(PC) 是多酚类化合物，属于生物类黄酮，是迄今为止最强有效的自由基清除剂之一。许多研究已经证明PC能通过多种途径对神经细胞起到保护作用。本项目通过建立大鼠脑出血模型后给予PC治疗，从而评价出血后PC的神经保护作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组 健康W istar 大鼠, 共40 只, 质量(250±30) g。按随机分组原则分成假手术A组(10只)、脑出血B组(10只)、PC低剂量(50 mg/kg)治疗C组(10只)及PC高剂量(200 mg/kg)治疗D组(10只)。PC于术前给予灌胃,1次/d,连续1周,于术前1 h再灌胃1次。假手术组和脑出血组给予等量的生理盐水灌胃。
1.2 动物模型的建立 大鼠用10%水合氯醛(300 mg/100 g)腹腔注射，暴露前囟，于前囟后0.2 mm，中线右3 mm处钻孔，微量加样器沿针孔垂直进针6 mm缓慢注入动物自体尾动脉血50ul。对照组只进针不注射。术后观察神经症状和体征,24 h后取脑。
1.3 免疫组化染色 按照SABC试剂盒说明书进行。鼠抗Bcl2、Bax和 caspase3多克隆抗体(Sigma公司), 工作浓度分别为1∶100 、1∶100和1∶200。在400倍镜下随机取血肿周围4个不重叠视野，计数caspase3 、bcl2和bax阳性细胞数(棕黄色颗粒为阳性细胞)。
1.4 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件数据处理, 结果以均数±标准差(x±s) 表示, 组间差异显著性检验采用方差分析，P<0.05有统计学意义。
2 结果
脑出血灶周围脑组织Caspase3蛋白的表达。A组脑组织中见少量caspase3蛋白表达。而B、C、D3组出血灶周围脑组织中可见caspase3阳性细胞表达水平增高。A组脑组织中未见Bax蛋白、见少量Bcl2表达。而B、C、D3组出血灶周围脑组织中可见Bax、Bcl2阳性细胞表达水平明显增高，其中B组表达水平最高，D组表达水平最低。
组别个数Caspase3阳性细胞数Bax阳性细胞数Bcl2阳性细胞数
A102.11±0.301.2±0.2
B1018.5±3.2*22.6±4.1*10.5±2.8*
C1013.6±3.2*16.3±4.1*22.4±5.7*
D109.0±2.6*14.2±3.7*25.3±4.3*
注：*与A组比较,P<0.05；B、C、D 3组间比较,各指标均P<0.05
3 讨论
原花青素(proanthocyanidin, PC)是从葡萄籽中提取出来的多酚类化合物，具有极强的抗氧化及清除自由基能力。Bagchi[1]等发现PC是迄今为止发现的最强有效的自由基清除剂之一，其清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍。PC能下调促凋亡基因cJun及P53表达有关，而且在体内外试验中均发现OPC能够改善血脑屏障的通透性[2]。
Bcl2是重要的凋亡抑制基因,主要通过阻止细胞凋亡的早期环节而发挥作用[3]。Bax是bcl2基因家族中重要的凋亡促进基因,可通过其自身形成的Bax同源二聚体发挥促进细胞凋亡作用[4]。脑出血灶周围脑组织Bax蛋白表达增加，表明Bax参于了出血灶周围脑组织中细胞凋亡的调控，应用花青素后Bax蛋白表达明显减少，同时花青素可以增加抗凋亡蛋白Bcl2表达，且与剂量相关。caspase3是caspase级联反应中最关键的效应酶,在凋亡执行过程中起重要作用[5]。花青素对脑出血的保护机制可能通过某种途径抑制caspase3蛋白表达,从而抑制细胞凋亡,挽救出血周围脑组织来实现的。
脑出血灶周围脑组织病理改变十分复杂,花青素对脑出血周围的脑组织有保护作用，可能与调控凋亡相关基因的表达,减少细胞凋亡的发生有关,为脑出血的治疗开辟新的道路。
参 考 文 献
[1] BagchiD,et al. Protection effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidant against TPA Induced hepatic and brain liquid peroxidation and DNA fragmentation and peritoneal macrophage activation in mice ......
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