急性呼吸道感染分泌物病毒病原检测标本选择
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【摘要】 目的 选择适宜的呼吸道标本，以方便急性呼吸道感染非细菌性病原体病原学诊断应用。以便明确病因，针对性地抗病毒治疗，避免临床不合理使用抗生素。方法 采集急性呼吸道感染患者的鼻咽分泌物(NPS)、痰和支气管肺泡灌洗液(BLF)为检测标本，应用聚合酶链反应技术(PCR)检测腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、肺炎衣原体(CP)和肺炎支原体(MP)4种非细菌性病原体，比较这3种呼吸道标本检测病原体结果的差异。结果 ADV、RSV、CP和MP的检出率，NPS标本分别为10.4%、29.2%、33.3%和18.8%，痰标本分别为10.4%、25.0%、35.4%和16.7%，BLF标本分别为8.3%、22.9%、27.1%和16.7%。上呼吸道感染和下呼吸道感染时，不同标本检测病原体的阳性率有一定的差别。结论 NPS、痰和BLF均可用做PCR检测急性呼吸道感染非细菌性病原体的标本，其中NPS容易获得、采集安全、能够满足病原学诊断需要，可以作为首选标本。
【关键词】
急性呼吸道感染；病原学；标本
呼吸道病毒感染病原学十分复杂。急性呼吸道感染(acuterespiratorytractinfections,ARI)是临床最常见的、对健康有较大损害的疾病之一，其致病病原体的种类多、有季节和地区的流行性的差异、不同病原体对药物的敏感性各异，因此检测ARI病原体是对ARI进行病因学诊断和制定确切治疗措施的决策性依据之一[1,2]。控制和治疗ARI的最佳时机是感染早期，但常规检测方法敏感性较低、周期较长、尤其对非细菌性微生物的检测很困难，不能满足临床早期诊断和治疗ARI的需要。聚合酶链反应技术(PCR)在检测各种微生物方面具有很好的应用价值[3，5]。应用PCR进行ARI病原学早期诊断的关键环节之一是选用合适的标本，因标本因素而导致PCR检测失败的例子并不少见。因此，在应用PCR进行ARI病原学检测时，对标本因素应引起足够的重视。选择适宜的标本，才能保证病原学诊断质量。
1 资料与方法
1.1 一般资料 急性呼吸道感染的临床诊断标准参照文献[6]。检测标本来自我院确诊且表现典型的ARI患者，其中，以上呼吸道感染为主要表现者26例，以下呼吸道和肺部症状为主要表现者22例。对同一患者采集鼻咽分泌物(NPS)、痰和支气管肺泡灌洗液(BLF)为检测标本，各48份。①采集NPS：用经高压消毒的棉拭子在咽部进行涂拭，获取NPS；②采集痰标本：用经高压消毒的痰盒留取深部痰液，获得痰标本；③采集BLF：进行支气管镜检查时，用输液用生理盐水做支气管肺泡灌洗，吸取灌洗液置于经高压消毒的Eppendoef管中，获得BLF。标本如暂时不能检测， 应及时处理
作者单位：525100广东省化州市中医院检验科
后于–20℃条件密封保存。
1.2 方法 应用PCR检测腺病毒(adenovirus，ADV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、肺炎衣原体(chlamydia pneumonia，CP)和肺炎支原体(mycoplama pneumonia，MP)。检测此4种病原体的PCR试剂为商品药盒。
1.2.1 处理标本 ①处理NPS：在拭子套管中加入2 ml经高压消毒的生理盐水，将NPS拭子浸入生理盐水中，在混旋仪上混旋洗涤NPS拭子5 min，将NPS洗涤液移入1.5 ml Eppendoef管中，15000rpm离心5 min，用移液器移取大部分上清，留取约200 μl包括管底沉淀物的洗涤液备用；②处理痰标本：向痰盒内加入约痰标本量2倍体积的蛋白酶K消化液，尽可能混匀，于52℃放置60 min，再转移至1.5 ml Eppendoef管中，15000rpm离心5 min，取上清备用；③处理BLF：将BLF移入1.5 ml Eppendoef管中，15000rpm离心5 min，用移液器移弃大部分上清，留取约200 μl包括管底沉淀物的洗涤液备用。
1.2.2 PCR操作 取100 μl标本处理液，提取RSV模版；再取100 μl标本处理液，提取ADV、CP和MP模版。按试剂盒操作说明进行模版提取、PCR反应体系制备、PCR扩增、扩增产物电泳、溴化乙啶染色等操作步骤。
1.2.3 结果判断 在PCR扩增产物紫外检测仪中观测溴化乙啶染色后的电泳条带，以出现与阳性对照(试剂盒中自代)齐同的核酸条带判读为阳性结果。
2 结果
各种呼吸道标本应用PCR检测病原体的结果，如表1所示。
表1
三种呼吸道标本应用PCR检测病原体的阳性结果 n(%)
标本例数ADVRSVCPMP
NPS485(10.4)14(29.2)16(33.3)9(18.8)
痰485(10.4)12(25.0)17(35.4)8(16.7)
BLF484(8.3)11(22.9)13(27.1)8(16.7)
上呼吸道组
NPS263(11.5)8(30.8)9(34.6)5(19.2)
痰262(7.7)6(23.7)6(23.7)4(15.4)
BLF2603(11.5)5(19.2)2(7.7)
下呼吸道组
NPS222(9.1)4(18.2)5(22.7)2(9.1)
痰223(13.6)7(31.8)7(31.8)5(22.7)
BLF223(13.6)6(27.3)8(36.4)6(27.3)
表1结果显示，①ARI时，病原体的总体阳性检测结果以NPS最高、痰标本次之、BLF最低。②上呼吸道感染为主要症状时，病原体的阳性检测结果以NPS最高、痰标本次之、BLF最低。③下呼吸道感染为主要症状时，病原体的阳性检测结果以BLF最高、痰标本次之、NPS最低。
3 讨论
ARI病原学检测结果是指导诊治ARI的依据，PCR技术在ARI病原学检测方面具有很高的应用价值，尤其对培养较困难的微生物，可以应用PCR技术方便、快捷地进行检测[35]。虽然PCR技术对检测标本的要求较低，但针对某一特定的疾病，由于病原体存在的部位不同，需要采集有病原体存在的标本，才可能检测到阳性结果。就ARI而言，病原体感染后，一般首先定植在鼻咽部的黏膜上皮细胞中，并在鼻咽部位的黏膜上皮细胞中进行复制增殖等生物学过程，此时在病原体及其代谢产物的作用下可产生上呼吸道感染症状；然后，病原体再向下呼吸道、肺泡等部位移植，产生下呼吸道、肺泡感染症状[3]。因此，进行ARI病原学检测时，应根据病情发展情况选择适宜的病原学检测标本。研究结果显示，应用PCR技术在NPS、痰和BLF 3种呼吸道标本中均可以检测到ADV、RSV、CP和MP阳性结果，其中，在上呼吸道感染组 ......
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