熊果酸对HL60细胞作用机制的初步研究(1)
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【摘要】 目的 探讨熊果酸在体外对急性早幼粒白血病HL60细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。 方法 采用体外细胞培养技术，荧光显微镜观察细胞结构变化、MTT法观察细胞生长抑制作用、流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化。结果 MTT法证实熊果酸对HL60细胞具有增殖抑制和杀伤效应，并呈浓度和时间依赖性。显微镜下可见HL60细胞出现典型凋亡细胞形态学改变。流式细胞仪检测细胞周期阻滞于G0/G1期。结论 熊果酸在体外可抑制急性早幼粒白血病HL60细胞增殖，诱导细胞凋亡。
【关键词】 熊果酸;HL60细胞;凋亡
Primary study on the effect of Ursolic Acid on HL60 cells
LI Jian-min， ZHOU Guo-xing， SONG Hai-peng， et al. Hunan Traditional Chinese Medical College，Zhuzhou 412000,China
【Abstract】 Objective To investigate anti-proliferation and apoptosis effects of Ursolic Acid on HL60 cells. Methods By culturing in vitro and treated with UA，anti-proliferation effects were assessed with methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) colorimetric assay and morphology of cells was observed under fluorescence microscope.The flow cytometry was used to detect apoptotic rates and cell cycle distribution. Results MTT showed that anti-proliferation effect of UA on HL60 Cells in a concentration and time dependent manner. Microscope showed that cell presented some morphologic features of apoptosis.The flow cytometry showed that after exposure to drugs cell-cycle was blocked at G0/G1 phase. Conclusion Ursolic Acid inhibits proliferation of HL60 cell and induces apoptosis.
【Key words】 Ursolic Acid；HL60 cell；Apoptosis
熊果酸(ursolic acid, UA) 又名乌索酸、乌苏酸，是广泛存在于芦笋、白花蛇舌草、女贞子、乌梅等天然植物和草药中的五环三萜类化合物，具有抗癌、抗炎、护肝、降血脂、降糖、抗氧化和抗病毒等多种生物学活性。近来研究表明，抗肿瘤活性是熊果酸最主要的药理作用，抗肿瘤作用具有多方面和全方位等特点[1]。研究证明，熊果酸对肺癌细胞A-549、胃癌SGC7901、白血病细胞P-388、L-1210 和THP-1等均具有细胞毒性作用[2]，但其作用机制一直未明确。本实验拟用熊果酸干预处理人急性早幼粒白血病HL60细胞，体外培养实验，进一步研究其对HL60细胞的增殖抑制、诱导凋亡作用及机制。
1 资料与方法
1.1 材料
急性早幼粒白血病HL60细胞由南华大学药物药理研究所惠赠。UA 为Sigma 公司产品，用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 溶解，配制成1 mmol/L的浓缩液，冻存于-20℃，临用前用培养基稀释并调整DMSO 终浓度为0.06%。四甲基偶氮唑蓝[MTT] 为Amresco 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将HL60细胞常规培养于含10%小牛血清的RPMI-1640 培养基中， 置37℃、5%CO2 培养箱中传代培养， 取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 增殖抑制实验 HL60细胞以2×104/孔接种于96 孔板, 用0、10、20、40 、80 μmol/L UA 分别处理24、48、72 h 后, 加入5 g/L MTT 作用4 h。4℃离心, 弃上清, 加入DMSO 振荡溶解后, 用荧光酶标仪于570 nm 波长下读取吸光度值, 以0 μmol/L UA 组为对照组, 计算增殖抑制率, 增殖抑制率=[ (对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值]×100%。
1.2.3 荧光显微镜细胞形态学观察 HL60细胞经0、20、40 、80 μmol/L UA 分别作用24 h 后，800 g/min 离心5 min， 收集细胞， PBS 洗涤，调整细胞数至2×105个/ml，吹打均匀，取25 μl悬液加到载玻片上，加5 μl吖啶橙染色后置荧光显微镜(波长250~350 nm)观察细胞形态。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期相分布及细胞凋亡率 取对数生长期HL60细胞用0、20、40 、80 μmol/L UA分别作用24 h，800 g/min 离心5 min，收集5×106个细胞，预冷PBS洗涤一次，加入70%预冷乙醇，4℃固定过夜。离心弃乙醇，PBS洗涤一次后加入RNA酶(1 mg/ml) 200 μl ......
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