利用siRNA敲除P-选择素受体CD24对黑色素瘤细胞增殖的影响
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【摘要】 目的 探讨CD24在黑色素瘤细胞增殖中的作用。 方法 B16F10细胞转染靶向CD24的RNA干扰质粒pSi-CD24，然后用RT-PCR和Western Blot观察其对细胞CD24表达的影响，用MTT法观察其对细胞增殖的抑制效果。 结果 在mRNA和蛋白水平均证实，转染pSi-CD24明显抑制B16F10细胞CD24的表达；与对照组相比较，pSi-CD24转染在48 h和72 h显著抑制细胞增殖速度。 结论 CD24具有促进黑色素瘤细胞体外增殖作用，在肿瘤的发生发展中起重要作用。
【关键词】 CD24;肿瘤；增殖
Effect of CD24 on cell proliferation capability in melanoma cells
LI Ming, LI Yan, CHEN Wei-qiang, et al.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical College, Guangdong 510006, China
【Abstract】 Objective To study the effect of CD24 on the proliferation ability of melanoma cells. Methods B16F10 cells were transfect with pSi-CD24, a siRNA plasmid target to CD24. Then the expression of CD24 was measured by RT-PCR and Western blot and the cell proliferation was assessed by MTT assay. Results CD24 expression was obviously down-regulated by pSi-CD24, and knockdown CD24 can effectively inhibited the proliferation of melanoma cells. Conclusion CD24 can enhance the proliferation of melanoma cells in vitro, which indicated CD24 play an important role in tumor growth.
【Key words】 CD24; Tumor; Proliferation
CD24是一种低分子量高度糖基化的蛋白质粘附分子，作为P-选择素的配体之一，CD24参与介导单核细胞、中性粒细胞与内皮细胞、血小板之间的粘附。近年来，临床研究发现CD24高表达于多种肿瘤细胞表面，并且与肿瘤的预后密切相关[1]。对于其作用机制，以往研究较多的集中的CD24与肿瘤转移的关系上，而CD24在肿瘤增殖中的作用研究尚不十分明确。因此，本实验用siRNA干扰CD24的表达，观察抑制CD24表达对细胞的增殖的影响，初步探讨CD24在肿瘤生长中的作用。
1 资料与方法
1.1 试剂与仪器 引物、分子量Marker和质粒提取试剂盒(大连TaKaRa公司)；两步法RT-PCR试剂盒、Trizol 、Lipofectamine 2000 (美国Invitrogen 公司)；抗CD24 抗体和抗β-actin抗体(美国Santa Cruze公司)；ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司)； 蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪(美国Bio-Rad公司)。人黑色素瘤细胞株B16F10为本室保存。靶向CD24的siRNA干扰质粒pSi-CD24由本室构建，按试剂盒说明书提取备用[2]。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和转染 取对数生长期的人黑色素瘤细胞B16F10细胞，接种于6孔细胞培养板内，待细胞达到80%融合时，按照说明书用脂质体Lipofectamine 2000转染细胞。实验分为对照组和pSi-CD24组。
1.2.2 B16F10细胞中CD24 mRNA表达的变化 转染24 h
后，用Trizol法提取细胞总RNA，按照说明书以Oligo-d(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA，用特异性引物扩增CD24和β-Actin。引物序列和扩增方法见本课题组前期发表的论文[2]。PCR产物用1.5%琼脂糖电泳，拍照，观察。
1.2.3 B16F10细胞中CD24蛋白表达的变化 转染48 h后按照试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白，取20 μg样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳，转膜，5 %的脱脂奶粉37℃封闭1 h，加抗CD24(1∶1000)或抗β-Actin(1∶1000)单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶3000) 37℃孵育1 h，ECL法显影，常规洗片拍照。
1.2.4 pSi-CD24对B16F10细胞增殖的影响 取空白对照组和pSi-CD24组细胞细胞，接种至96孔板上，各组设4孔，在转染后0、24、48和72 h后加入MIT(5 mg/m1)20 μl，用MTT法检测细胞增殖情况，并绘制细胞生长曲线。
2 结果
2.1 pSi-CD24对CD24 mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR和Western blot结果显示，在正常情况下，黑色素瘤细胞B16F10高表达CD24，而转染重组质粒pSi-CD24后，B16F10细胞中CD24 mRNA和蛋白水平的表达均明显降低，说明重组质粒pSi-CD24能抑制CD24的表达。结果见图1。
2.2 pSi-CD24对B16F10细胞增殖的影响 MTT结果显示，转染pSi-CD24质粒后，黑色素瘤细胞B16F10的增值明显被抑制，在48 h和72 h与对照组差异有统计学意义。结果见图2。
3 讨论
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种简单有效的基因沉默工具，主要通过诱导序列特异性的mRNA降解，从而产生相应的功能表型缺失，现已被广泛应用于基因治疗和功能基因组学的研究中[3]。在哺乳动物细胞的RNAi研究中，通过质粒等表达载体在细胞内直接转录形成siRNA具有经济和容易操作、作用持续时间长等优点，是目前siRNA最常用的方法。我们前期采用具有RNA聚合酶Ⅲ启动子的pSilencer 3.1载体，成功构建了靶向CD24基因的表达载体pSi-CD24[2]。本实验用RT-PCR和Western blot在黑色素瘤细胞B16F10中发现，转染pSi-CD24质粒后细胞CD24在mRNA水平和蛋白水平的表达较对照组均有明显降低，说明pSi-CD24可以在细胞内持续表达siRNA, 高效特异地抑制CD24的表达，为进一步研究CD24基因的功能和以CD24为靶点进行肿瘤治疗奠定了基础。
作为P-选择素的配体，CD24高表达能增强肿瘤的侵袭能力和转移能力[4]。研究发现 ......
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