血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对正常大鼠肠黏膜屏障的影响
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1.4 组织标本的收集
于末次灌胃后24 h，使用过量水合氯醛麻醉动物，无菌条件下打开胸腹腔，从大鼠的右心室抽取2 ml-3 ml的血液注入血培养瓶中。另距回肠末端取下5 cm长度的一段回肠，其中1 cm用10%甲醛溶液浸泡，余下的回肠立即保存在-80℃冰箱内。
1.5 检测指标
1.5.1 组织学检查
光镜(100倍)下观察肠黏膜形态，采用Chiu’s 6级评分法评价肠黏膜损伤程度： 0分为正常；1分为绒毛顶端上皮下间隙增大；2分为上皮层和固有层中度分离；3分为绒毛两侧有大量分离伴有部分绒毛顶端破损；4分为绒毛破损伴有固有层毛细血管大量暴露；5分为固有层破坏、出血及溃疡。
1.5.2 肠组织MPO活性
采用比色法测量肠组织内的MPO活性，MPO活性大小主要反映组织内的中性粒细胞(PMN)数量，具体操作按照说明书进行。
1.5.3 细菌移位
将抽取的1 ml血液立即注入血培养瓶中，利用BACTEC9120全自动血培养仪和Bacton Dickinson Bactec 9000 软件发现有细菌生长的血培养瓶，然后再利用生物梅里埃APR鉴定系统鉴定细菌种类。
1.6 统计学方法
对于定量数据，采用均数±标准差，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析；使用SPSS 13.0英文版统计软件进行统计分析，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 组织学检查
各组肠黏膜Chius评分比较无统计学意义,提示各灌胃组对肠道无损害作用。
2.2 肠组织MPO活性的比较
如表1所示：与LL1t组比较，HO2t组和PBS1t组的肠组织内MPO活性较高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与LL1t组比较，HO1t组和HO3t组的MPO活性无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；说明各灌胃组对肠道组织MPO的影响相似。
2.3 细菌移位
HO1t组、PBS1t组和LL1t组血培养阴性，HO2t组有1例、HO3t组有2例血液细菌培养阳性，移位的细菌按出现次数依次为：大肠杆菌、木糖葡萄球菌、类白喉棒状菌等。
3 讨论
肠道功能的改变，首先表现为肠黏膜形态的变化，出现黏膜水肿和绒毛断裂，发生肠黏膜屏障功能减退。通过Chius评分可以判断出肠黏膜受损情况，是反映其功能改变的形态学指标[11]。
在失血性休克期，肠道内的正常菌群依赖肠道内的营养物质大量繁殖，细菌和(或)其释放的内毒素通过受损的肠黏膜屏障转移到肠道外，这个过程称之为细菌移位。细菌移位导致的炎症介质释放，明显比肠道因缺血缺氧刺激引起的炎症介质释放要多[12]。炎症介质通过激活各种信号通路如激活NF-kB信号通路，导致肠道炎症反应引起肠黏膜屏障功能的改变，甚者引起全身炎症反应综合(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)[13]。
PMN作为人体主要的免疫细胞，发挥重要的免疫防御功能，担负着吞噬消灭外来细菌、病毒及其他微生物的使命。正常情况下，肠道内皮细胞通过细胞间连接和粘附功能，形成有效的肠黏膜屏障，使机体免于外界伤害因素的损害。而在病理情况下，大量活化的PMN通过伪足的机械作用和释放各种氧化物质(ROS)，造成肠黏膜屏障受损，发生肠黏膜水肿和肠黏膜屏障功能减退，这是肠道炎症反应发生的重要机制。而机体则分泌具有保护性机制的酶类[14]，如HO-1。HO-1的保护作用包括：抗炎症反应、抗凋亡、抗纤维化[15]，其保护机制与HO-1降解血红素的代谢产物CO、胆绿素、胆红素、铁蛋白相关。
另外一些研究发现,细胞中HO-1 的保护作用是有阈值的。HO-1 适量表达,可以减少蛋白质氧化、脂质过氧化及细胞死亡;表达量过高时,则会促进乳酸脱氢酶的释放和降低谷胱甘肽转移酶含量,破坏细胞膜的完整性[16]。
本实验室采用的乳酸菌表达系统是一种目前国际上高度通用、食品级的NICE系统(Nisin Controlled Expression system)，被广泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表达[17],这种食品级微生物能在肠道内存活2~3 d,其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应[10]。通过外源性的补充肠道内的乳酸乳球菌，可以将它携带的克隆基因带到肠道内，发挥药理作用。
本研究条件下，各组Chius评分和MPO的差异无统计学意义，说明肠黏膜屏障功能没有发生明显变化。HO2t组和HO3t组发生细菌移位，这可能与大量乳酸乳球菌在肠道内形成的酸胁迫有关[18]，从而对局部细胞的生理功能产生影响，包括破坏细胞膜，抑制多种酶和转运系统的活性等[19]，但这种细菌移位的发生后果以及可能导致的并发症，本研究没有深入值得探讨。因此，在如何提高乳酸工程菌体内分泌重组HO-1的含量,同时不改变胃肠道微环境、破坏肠黏膜屏障等方面需要进一步研究,使乳酸工程菌的基因治疗达到一个理想的效果。
4 结论
本研究条件下，HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃，不会随着灌胃次数增加而影响肠黏膜屏障的功能。
参考文献
[1]Moncure M, Chen L, Childs EW, et al. Heme-Oxygenase-1 mRNA expression affects hemorrhagic shock-induced leukocyte adherence. The Journal of TRAUMA-injury, Infection, and Critical Care, 2003, 55(1):118-125.
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[4]高新跃，周强，庞庆丰，等.两种液体复苏对失血性休克大鼠肠黏膜屏障的影响.中华急诊医学杂志，2008，17(2)：149-152.
[5]高新跃，任从才，张欣，等.血红素加氧酶1重组乳酸乳球菌灌胃对失血性休克大鼠肠黏膜屏障的保护作用.中国危重病急救医学,2007,19(4):225-228.
[6]高新跃，任从才，张欣,等.血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对失血性休克大鼠肠黏膜屏障的保护作用.中国危重病急救医学,2007,19(4):225-228 ......
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