褪黑素对烫伤大鼠脑组织抗氧化能力与星形胶质细胞的影响(2)
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1.3 实验方法
1.3.1 烫伤模型构建 单笼喂养1周后制成烫伤模型，烫伤前禁食12 h。参照叶建勋等方法[4]略做改良进行，将烫伤仪温度设置在105℃，待压力锅内压力达到70kPa时，多次启动通气开关，使整个通气管道温度加热到所设定值，管出口处凝结水减少；设定通气时间为10 s。所有动物烫伤前1 d用10%硫化钠(Na2S)脱去背部的毛，制作烫伤模型前腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，将烫伤仪喷射盘置于大鼠背部固定，启动控制器开关，9s后喷射口蒸气停止，完成致伤过程。烫伤面积约30%，烫伤程度Ⅲ伤(病理切片证实)。伤后迅速脱离热源,保温。MT治疗组伤后10 min, 3 h分别两次给予MT(10 mg/kg)溶液腹腔注射治疗, 正常对照组与烫伤组给予等量体积的生理盐水。
1.3.2 脑组织匀浆的制备 每组5只大鼠于MT治疗结束后1 h采用脱颈椎法处死取脑，置冷生理盐水中冲净血液后取出，用滤纸吸干水分，低温环境下迅速称重，用移液管量取冷生理盐水，生理盐水的体积总量是组织块重量的9倍，在生理盐水中剪碎组织块。倒人匀浆管中进行匀浆，充分研碎，倒入试管中，即制备好了10%的组织匀浆。将其置于冷冻离心机中，以3500 r/min离心10 min，提取上清液用于抗氧化酶活力与MDA的检测。
1.3.3 GSH、SOD、MDA的检测
取脑组织匀浆上清液1.0 ml，严格按照试剂盒的说明分别采用比色法、黄嘌呤氧化酶法测定和硫代巴比妥酸法测定GSH、SOD、MDA吸光度值，最后分别计算出样本中的GSH、SOD、MDA含量。
1.3.4 GFAP免疫组织化学染色 剩余大鼠麻醉后取脑、石蜡包埋，冠状切片、贴片。石蜡切片常规脱蜡至水；用3%的H2O2灭活内源性酶，用蒸馏水洗涤；微波修复抗原1次，冷却后用0.02 mol/L的PBS溶液冲洗；滴加5%正常山羊血清封闭液，室温下反应20 min，甩去多余的液体，不洗；滴加浓度为1∶200的兔抗GFAP，湿盒中孵育，过夜，PBS冲洗3次，2 min/次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，湿盒中37 ℃孵育20 min，PBS冲洗3次，2 min/次；滴加SABC，湿盒中孵育20 min，PBS冲洗；DAB显色，光镜下控制显色深度，蒸馏水洗涤3次，2 min/次；脱水、透明、封片。以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。对照组切片用PBS冲洗液取代一抗，其余步骤同实验组。
1.4 图像处理 用Mias图像分析软件，对每个鼠脑取相同间隔的3张切片，对每张切片黑质致密部各测5个视野,在同一放大倍数(物镜40)、同一视场面积、同一背景光强度下，分别对额叶皮质GFAP免疫组化阳性神经元进行计数，测量GFAP阳性反应产物的平均光密度值。
1.5 统计学方法 测定结果用SPSS12.0(SPSS公司)统计软件进行统计处理,分析结果用(x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组脑组织GSH、SOD与MDA测定结果 比色法测得大鼠脑组织GSH、SOD与MDA含量，见表1。随着烫伤后时间的延长，大鼠的脑组织SOD逐渐下降，而含水量逐渐增多，差异有统计学意义(P<0.05)。
五组大鼠脑组织GSH、MDA含水量比较(n=5，x±s)
组别GSH(g/L) MDA (μmol/L) SOD(μmol/L)
正常对照组 18.41±1.64 3.25±0.8585.12±1.67
烫伤组 8.24±1.59▲9.74±0.75▲ 60.12±1.72▲
MT治疗组 12.35±1.70▲* 7.67±0.69▲*72.12±1.39▲*
注：与正常对照组相比，▲ P<0.05;与烫伤相比，*P<0.05
2.2 GFAP免疫组织化学染色结果 正常对照组GFAP阳性细胞染色浅, 细胞呈星形、体积较少, 突起纤细而且短,分布稀疏(图A)；烫伤组与MT治疗组GFAP阳性细胞较多，胞浆内有丰富的棕黄色阳性反应颗粒，细胞呈蜘蛛状，胞体较大，突起增多、增长、变粗(图B、C)。与烫伤组相比，MT治疗组GFAP阳性神经元、平均光密度值显著减少,仍多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。 GFAP阳性神经元及其平均光密度值计数，见表2。
3组大鼠脑皮质GFAP阳性细胞计数及其阳性产物平均光密度比较(n=5，x±s)
组别GFAP阳性神细胞GFAP平均光密度值
正常对照组7.52±0.69 0.28±0.13
烫伤组 15.78±0.27▲ 0.77±0.19▲
MT治疗组10.67±0.68▲*0.45±0.15▲*
注：与正常对照组相比，▲ P<0.05;与烫伤后3 h组相比，*P<0.05；
3 讨论
机体内酶促反应和非酶促反应时可能产生自由基，自由基与衰老有着密切的联系。正常机体内自由基的产生与消除处于动态平衡，一旦这种平衡被打破，自由基便会引起生物大分子如脂质、蛋白质、核酸的损伤，导致细胞结构的破坏和机体的衰老。烫伤使得血脑屏障透过增大，刺激脑细胞活性氧自由基的产生，使中枢神经系统氧化应激水平增强[5]，同时机体可通过抗氧化物和抗氧化酶来清除过量的活性氧和自由基，使抗氧化酶和(或)抗氧化物水平下降。其中GSH是机体重要的抗氧化物质，SOD也是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物。Zang等[6]报道40%的烧伤大鼠血清MDA增加30%～50%；GSH下降60%等，过量自由基严重损伤了各种器官。本实验结果显示，烫伤后大鼠脑组织MDA和SOD含量增加、GSH下降，提示氧自由基参与烫伤后继发脑损伤的病理过程,表明大鼠脑组织抗氧化下降。抗氧化下降可能烫伤使得血脑屏障透过增大，刺激脑细胞活化产生大量超氧阴离子,触发了细胞膜的脂质过氧化反应,产生过多的脂质过氧化物。同时脑发生缺氧、缺血导致体内GSH活力降低,清除氧自由基的能力降低,进一步使氧自由基在细胞内蓄积。
MT是松果体分泌的吲哚类神经内分泌激素。褪黑素通过清除自由基，抗氧化和抑制脂质的过氧化反应保护细胞结构、防DNA损伤、降低体内过氧化物的含量。Russe等人的研究发现，褪黑激素对黄樟素(一种通过释放自由基而损伤DNA的致癌物)引起DNA损伤的保护作用可达到99%，且呈剂量反应关系[7]。褪黑素对外源性毒物(如百草枯)引起的过氧化以及产生的自由基所造成的组织损伤有明显的拮抗作用。本实验结果证实,给予MT后大鼠脑组织, GSH增加、MDA与SOD含量显著下降,表明MT发挥了自由基清除作用。
星形胶质是中枢神经系统内数量最多的一种胶质细胞 ......
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