中药有效成分Vam3对小鼠气道非特异性炎症模型TH1/TH2应答的调节作用(2)
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1.4 血清CA特异性抗体的测定 各实验组小鼠APTI测定结束后立即取血清并保存于-80℃。CA特异性IgE的测定用ELISA方法[13]。
为了测定CA特异性IgG2a和IgG1，用CA包被酶标板后进行封闭和洗涤。样品1∶50稀释后加入酶标板中4℃孵浴过夜。洗板后加入生物素化的大鼠抗小鼠IgG2a和IgG1的单抗，室温孵浴45 min。加入亲和素过氧化物酶(Sigma,1∶1000稀释)，室温置15 min。洗板后，加入2,2′-azine-bis，室温置30 min，酶标仪405nm处读数。
由于没有商业化小鼠抗CA抗体，小鼠CA抗原特异性IgE、IgG2a、IgG1的浓度计算参照测定小鼠抗DNPIgE、IgG2a、IgG1时的标准曲线。简单的讲，DNP-清蛋白和CA以相同的浓度包被酶标板，4℃过夜、洗板并封闭。小鼠抗DNP IgE、IgG2a、IgG1抗体依次1∶2稀释10次，分别加入10个孔中。，起始浓度为1000ng/ml。其他步骤同上。所有实验均采用双孔，变异率>10%则重复实验以保证实验的精确性。
1.5 细胞培养和细胞因子定量 每组实验小鼠的脾细胞并悬于完全培养液中(RPMI1640中含10%的FBS,1%的青霉素和链霉素及1%的谷氨酰胺)。细胞在24孔培养板培养，每孔4×106/ml个细胞，培养液中含50 μg/ml的CA。细胞培养液中加入ConA(2 μg/ml)作为阳性对照并设阴性对照。培养72 h后收集上清。脾细胞培养上清中的IL-4IL-5IL-13和IFN-γ水平的测定用ELISA方法，操作参照说明书。
1.6 统计学方法 实验数据用SigmaStat 2.03统计软件进行处理。各治疗组之间的差异由ANOVA决定。
2 结果
2.1 中药有效成分Vam3对抗原特异性抗体应答的影响 为了确定中药有效成分Vam3治疗对体液免疫应答的影响，我们测定了血清CA特异性IgE和IgG2a的水平。如图2所示，中药有效成分Vam3治疗组的IgE水平的显著降低(P<0.01)。与盐水处理组相比，IgG2a的水平略有升高，但没有统计学意义。地塞米松治疗组的IgE水平显著降低(与盐水处理组相比，P<0.01),但本组IgG2a的水平也显著降低(与盐水对照组相比，P<0.05)。
2.2 Vam3对T细胞细胞因子应答的影响 为了确定中药有效成分Vam3对于T细胞应答类型的影响，我们通过脾细胞培养方法来评价Vam3和地塞米松对T细胞细胞因子分泌的影响。如图3所示，抗原致敏、发敏的盐水处理组比空白对照组的IL-4、IL-5、IL-13水平显著显著升高，而IFN-γ水平显著降低，表明应答为TH2占优势的应答。然而与盐水处理组相比，中药有效成分Vam3组的IL-4分泌被完全阻断，而IL-5和IL-13的水平下降近40%。有趣的是，中药有效成分Vam3治疗组CA诱导的IFN-γ分泌量比盐水处理组升高约27%，且ConA诱导的IFN-γ水平与空白对照组相同。地塞米松治疗组则不同，无IL-4分泌，且IL-5和IL-13水平显著降低，但CA诱导的IFN-γ分泌被阻断，且ConA诱导的IFN-γ分泌比空白对照组显著降低。
图2 血清CA特异性抗体。(盐水组，n16; Vam3组，n11,地塞米松组，n12;空白对照组，n14)进行血清特异性抗体测定，用ELISA方法进行。A:IgE水平B：IgG2a水平。数据均数±SEM由每组4-6只小鼠数据进行计算。
图3 小鼠脾脏细胞培养上清中细胞因子的产生。细胞分离后分别用含有CA(50 μg/ml)、ConA(2 μg/ml)和不含其他成分的培养基进行培养。培养72 h后收集上清。通过ELISA方法测定上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。结果为重复实验的平均值。
3 讨论
患有变应性疾病的人或动物模型，当再次接触过敏原后，IgE可以通过使肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒来介导过敏反应[14～17]。相反IgG2a的产生则被认为对机体有利[18]。以前的研究表明，一些抗炎的传统中草药方剂，如小青龙汤，可以抑制实验动物的非特异性炎症，表明可能对该类疾病具有治疗作用[19]。Vam3是从山葡萄根(Vitis Amurensis Rupr.)提取的二苯乙烯低聚体类化合物。研究表明,中药有效成分Vam3治疗后来可以显著减少抗原特异性血清IgE的产生，IgG2a水平略有升高而IgG1水平下降。表明Vam3这种成分具有免疫调节作用，因而可能适于治疗COPD、哮喘等呼吸道非特异炎症性疾病。
正如Romagnani的综述中所讲[20]，TH2型细胞因子在哮喘的发病机制中具有重要作用。IL-4/IL-13促进B细胞类型转换产生IgE和粘液分泌增多，而IL-5对于嗜酸性粒细胞的富集、活化和生存起主要作用。本研究发现，与盐水处理组相比，Vam3下调了IL-4、IL-5和IL-13的水平。这些结果表明，中药有效成分Vam3抑制非特异性气道炎症与其下调TH2应答有关。中药有效成分Vam3可以抑制3种主要的TH2型细胞因子，因而可以提供比单用抗IL-4、IL-5和IL-13更全面的治疗方法。
在这个模型中，地塞米松也可以抑制气道炎症 ......
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