子宫内膜癌中Syk基因的表达及其甲基化分析(2)
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参见附件(3703KB，4页)。
1.2 主要试剂 RNA 抽提及RTPCR试剂盒均购自大连宝生物公司、DNA提取试剂盒购自上海华舜试剂公司、甲基化修饰及纯化试剂盒为美国EPIGENTEK公司产品。
1.3 RNA提取 取100 mg的标本应用RNA提取试剂盒,按说明书要求提取RNA后于紫外分光光度计测OD260/OD280定量并检测其纯度，70℃冰箱保存待用。
1.4 RTPCR反应 取 1 μg总RNA逆转录为cDNA 后，取2.0 μl cDNA 为模板于20 μl体系进行PCR 扩增，引物由上海生物工程公司合成，Syk引物序列Primer1：5TTCTCCAGCAAAAGCGATGTCT3， Primer2：5TTTC CACATCGTATGTCCAGCA3，产物长度199bp,反应参数：94 ℃ 5 min,94 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s, 30 个循环, 72 ℃ 10 min。内参照GAPDH引物Primer1：5TCATGGGTGTGAACCATGAGAA3， Primer2： 5GGCAT GGACTGTG GTCATGAG3，扩增片断115bp，反应参数：95 ℃ 15 min,95 ℃ 1 min,62℃ 1 min,72 ℃ 1 min, 30 个循环, 72 ℃ 10 min。3 μl PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下经Biocaptmw软件分析进行半定量分析。
1.5 DNA 的准备和MSP 取50～100 mg标本按照DNA提取试剂盒的说明书提取DNA，测定OD值确定其浓度和纯度。DNA甲基化修饰严格按照试剂盒上的说明。修饰的DNA 应用PCR 试剂盒进行巢式双重PCR,首轮PCR 的引物为:5GATTAAGATATATTTTAGGGAATATG3(sense), 5CACCTATATTTTATTCACATAATTTC3(antisense),扩增长度600 bp。PCR 反应条件: 94 ℃ 5 min,94 ℃30 s,57 ℃30 s,72℃30 s,35 个循环,72 ℃延伸10 min。取首轮PCR 产物1.0 μl 进行第2 轮双重PCR。甲基化特异性引物为:5CGATTTCGCGGGTTTCGTTC3(sense),5AAAACGA ACGCAACGC GAAAC3(antisense),扩增长度243 bp,包含9 个Cp G 岛。非甲基特异性引物为: 5ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG3(sense), 5 ACTTCCT TAACACACCCAAAC3(antisense)， 扩增长度140 bp,包含8 个Cp G 岛。甲基化和非甲基化的引物置于同一个反应中进行扩增,反应条件除甲基化的退火温度为59 ℃30 s、非甲基化的退火温度为54 ℃30 s，25 个循环外,其他均与首轮PCR 条件相同。第2 轮PCR 产物2.0～5.0 μl 经过2 %琼脂糖电泳、溴化乙锭染色后,在凝胶成像系统下观察成像记录结果。双重PCR 产物中,出现243 bp 产物,则为Syk基因存在甲基化,出现140 bp 产物,认为基因存在非甲基化。
1.6 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理,两组之间的比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，认为P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Syk基因在不同子宫内膜组织中的表达
统计结果表明，子宫内膜癌组织中SykmRNA基因表达水平明显低于癌周组织(t=2.75,P<0.01)、不典型增生(t=4.55,P<0.01)、复杂型増生过长(t=5.79,P<0.01)、单纯型增生(t=7.90,P<0.01)及正常子宫内膜组织(t=8.34,P<0.01)；SykmRNA基因的表达在癌周组织明显低于不典型增生组织(t=2.63,P<0.05)；而在后者中的表达明显低于复杂型増生过长(t=2.47,P<0.05)、单纯型增生过长(t=3.09,P<0.05)及正常子宫内膜组织(t=2.29,P<0.05)；但是其在复杂型増生过长、单纯型增生过长及正常子宫内膜组织之间的表达水平差异无显著性(F=2.31,P>0.05)，见表1。
表1
SykmRNA基因在不同子宫内膜组织中的表达水平(x±s)
组别例数SykmRNA基因表达水平
子宫内膜癌520.54±0.33
癌周组织520.71±0.30
不典型增生300.92±0.42
复杂型増生过长281.18±0.38
单纯型增生过长301.28±0.48
正常子宫内膜401.31±0.86
图1
SykmRNA电泳图
N1:正常组织；N2：癌周组织；T：肿瘤组织；C: 对应内参GAPDH
2.2 SykmRNA基因在不同子宫内膜组织中阳性表达率
SykmRNA基因在子宫内膜良、恶性增生及正常子宫内膜间的阳性表达率不同或不完全相同(χ2=81.1,P<0.01),子宫内膜癌中SykmRNA基因阳性表达率明显低于癌周组织(χ2=51 ......
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