血管性痴呆小鼠海马神经细胞钙稳态及石杉碱甲的影响
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【摘要】目的观察石杉碱甲对VD小鼠海马神经细胞钙稳态的影响。方法制备VD动物模型，并设立假手术组作，选用石杉碱甲为治疗组。进行学习、记忆成绩测试，在LSCM下观察海马神经细胞静息态[Ca2+]i及其在去极化时的动态变化。结果模型组的学习和记忆成绩低于假手术组及治疗组；而模型组静息态[Ca2+]i显著高于假手术组、治疗组，并且海马神经细胞[Ca2+]i升高幅度明显降低，恢复时间明显延长。结论VD小鼠海马神经细胞钙稳态变化参与了其发病机制，石杉碱甲可改善海马神经细胞钙稳态变化。
【关键词】血管性痴呆；海马；钙稳态；石杉碱甲
作者单位：272111济宁市第一人民医院神经内科随着高龄人口和脑卒中存活率的增高，血管性痴呆(VD)的发病愈来愈多。由于生理浓度的钙离子作为神经细胞内第二信使，参与了学习和记忆过程；因此，神经细胞[Ca2+]i研究一直倍受人们关注。
1材料与方法
1.1动物模型制备与分组实验动物选用2月龄雄性昆明小鼠。采用双侧颈总动脉结扎再灌注的方式制备VD模型；假手术组仅暴露双侧颈总动脉；治疗组先制备模型，术后第2天给予石杉碱甲0.05 μg/g/d 30 d。
1.2学习、记忆成绩测试跳台试验装置为被动回避反应箱，术后第29天测试学习成绩，记录动物反应时间、错误次数；24 h后测试记忆成绩(潜伏时间及错误次数)。
1.3LSCM下观察神经细胞静息态[Ca2+]i及其去极化兴奋时的钙震荡将小鼠断头处死，在低温下分离出海马组织，制备海马活细胞。滴加荧光探针Fluo3(浓度1000 mM)1 μl，在BioRad MRC1024型LSCM下，对锥体细胞进行激光扫描观察，数据为细胞内荧光像素的相对值；观察静息态[Ca2+]i后，加入20 μl 50 mmol/L氯化钾溶液，观察神经细胞的钙震荡变化，记录其[Ca2+]i的上升时间、下降时间以及升高的峰值和幅度。
1.4数据分析采用单因素方差分析，运用SAS软件进行处理，并采用SNK法进行3组之间的两两比较。
2结果
2.1跳台试验表1可见，模型组的学习成绩和记忆成绩均劣于假手术组，治疗组的学习成绩和记忆成绩均优于模型组。
2.2海马神经细胞钙稳态变化表2可见，模型组静息态[Ca2+]i显著高于假手术组、治疗组，并且去极化后海马神经细胞[Ca2+]i升高幅度明显降低，恢复时间明显延长。
表1各组小鼠学习和记忆成绩比较
组别学习成绩记忆成绩反应时间(sec)错误次数潜伏时间(sec)错误次数假手术组(n=23)30.95±18.181.17±1.20138.09±39.520.89±0.96模型组(n=16)112.65±20.62*4.17±2.66*33.02±27.55*3.61±3.18*治疗组(n=22)35.72±16.24△1.28±1.32△133.76±48.07△0.94±1.06△*P<0.05与假手术组比较；△P<0.05 与模型组比较。
2讨论
VD是因脑血管疾病所致的认知功能障碍综合征。近几年来，对其发病机制及治疗的研究愈来愈多。本实验采用双侧颈总动脉线结法造成脑组织反复缺血再灌注损伤，并且经行为学测试存在学习和记忆功能障碍，是比较理想的血管性痴呆动物模型。
VD小鼠海马神经细胞钙稳态失衡，表现为：静息态[Ca2+]i升高，去极化时升高幅度降低、恢复时间延长。与小鼠学习和记忆成绩降低相一致，可能参与了VD的分子生物学发病机制。静息态[Ca2+]i升高可以促进神经元凋亡或迟发性坏死，进而降低了海马参与学习和记忆的功能[1]。同时，海马神经细胞静息态[Ca2+]i过高可能升高了突触传递的阈值，易化突触的抑制，降低突触传导、神经递质释放、信号转导等，从而导致了学习记忆功能障碍。去极化时[Ca2+]i升高幅度降低反映了Ca2+内流减少，降低了突触后神经细胞内Ca2+引起的激酶激活及参与学习和记忆的基因转录，降低了神经递质和突触素的合成，导致LTP的诱导和维持障碍，出现学习和记忆功能受损[2]。并且，VD小鼠海马神经元受刺激后，[Ca2+]i持续升高，恢复到静息态水平的时间较长，从而使细胞凋亡基因的启动、突触传递的阈值升高、钙依赖性激酶的激活减少等进一步加重。至于石杉碱甲改善VD海马神经细胞钙稳态的机理尚在探讨中。有学者研究，石杉碱甲具有神经细胞NMDA受体拮抗作用，并且这种作用与其胆碱酯酶抑制作用无关系；其与非竞争性NMDA受体拮抗剂MK801的作用没有明显差别[3]。Gordon等进一步研究，石杉碱甲通过NMDA受体拮抗作用减轻兴奋性氨基酸的毒性及继发的Ca2+内流，从而减轻缺血缺氧引起的神经元变性、坏死；这种作用对M型或N型乙酰胆碱受体及腺苷受体无影响[4]。
因此，我们认为：在石杉碱甲的治疗作用下，VD海马神经细胞钙稳态受缺血缺氧影响不明显，从而可以维持钙稳态于正常水平，使神经细胞及其生理功能免于损伤。
参考文献
[1]Saski C, Kitagawa H. Temporal profile of cytochrome C and caspase3 immunoreactives and TUNEL staining after permanent middle cerebral artery occlusion in rats ......
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