罗格列酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏PPARγ、UCP2表达的影响(1)
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【摘要】 目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)及解偶联蛋白2(UCP2)在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病中的作用；观察罗格列酮对实验性NAFLD的治疗效果。方法 60只雄性SD大鼠随机分为对照组，模型组，罗格列酮低剂量及高剂量治疗组。RT-PCR检测肝脏组织PPARγ及UCP2表达情况。结果 随着造模时间延长，高脂饮食使大鼠肝脏组织中PPARγmRNA、UCP2 mRNA表达逐渐增强(P<0.05)；罗格列酮治疗能够下调两者的表达(P<0.05)。结论 高脂饮食可使模型大鼠肝脏组织中PPARγ及UCP2表达增强。罗格列酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠具有一定的治疗作用，并呈一定的时间-剂量依赖性，其作用可能通过下调肝脏组织中PPARγ及其下游靶基因UCP2的表达来实现。
【关键词】 罗格列酮；非酒精性脂肪性肝病；过氧化物酶体增殖物激活受体γ；解偶联蛋白2
非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化。NAFLD的发病机制目前尚不明确。其中以“二次打击”学说目前在学术界较为流行，初次打击主要为胰岛素抵抗(IR)，二次打击主要为氧应激和脂质过氧化反应。近年来，随着非酒精性脂肪性肝病的深入研究，大量的证据表明NAFLD患者及动物模型体内存在胰岛素抵抗现象及能量代谢失衡，且其不同组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) 及解偶联蛋白2(UCP2)的表达均发生了变化[1-4]。其中UCP2又是PPARγ下游的靶基因，PPARγ可以在转录水平调节UCP2的表达[5，6]。它们可能成为NAFLD治疗的新靶点。
1 材料和方法
1.1 动物模型建立
健康雄性SD大鼠60只，体重150±10 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，正常饲养1周后随机分为正常饮食对照组(18只)，高脂饮食模型组(18只)及罗格列酮治疗组(24只)，其中罗格列酮治疗组分为低剂量治疗组[共12只、罗格列酮2 mg/(kg•d)]和高剂量治疗组[共12只、罗格列酮24 mg/(kg•d)]。对照组及模型组分别于实验的第4、8、12周末各处死6只大鼠。治疗组予以与模型组一致的高脂饮食(88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇)[2]，于实验第4周末开始给药，于实验的第8、12周末各处死6只大鼠。
1.2 RT-PCR检测肝脏组织PPARγ mRNA、UCP2 mRNA
从Genbank查获目标基因PPARγ、UCP2及内参照β-actin的mRNA序列。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。cDNA第一链合成反应条件为：42℃15 min，95℃ 5 min， 4℃ 5 min。PPARγ、UCP2及β-actin的PCR反应条件分别为：94℃ 5 min；94℃ 30s，58℃ 40s，72℃ 45s， 30个循环； 72℃ 10 min。94℃ 5 min；94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 45s，32个循环； 72℃ 10 min。94℃ 5 min；94℃ 30s，62℃ 40s，72℃ 30s，28个循环； 72℃ 10 min。目标基因PCR产物的相对量＝目标基因电泳条带灰度积分/β-actin电泳条带灰度积分。
1.3 统计学方法
用SPSS 13.0软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PPARγ mRNA的表达 随着造模时间延长，高脂饮食使大鼠肝脏组织中的PPARγ mRNA表达逐渐增强，与肝细胞脂肪变性的程度有关。罗格列酮能够下调脂肪变的肝细胞内PPARγ mRNA的表达，并可能有一定的时间-剂量依赖性。
2.2 UCP2 mRNA的表达 随着造模时间延长，高脂饮食使大鼠肝脏组织中的UCP2 mRNA表达逐渐增强。罗格列酮可能时间-剂量依赖性地下调脂肪变的肝细胞内UCP2 mRNA的表达。
3 讨论
近年来，随着饮食结构、生活方式的改变，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病率呈上升趋势。随着肥胖和糖尿病的高发，NAFLD现已成为我国常见的慢性肝病之一，严重危害人民健康。且以其低龄化发展趋势、慢性进展性经过、作为隐源性肝硬化的重要病因等特点，越来越显示出其临床重要性。因此，建立模拟人类的营养失调性NAFLD动物模型，研究其发病机制、治疗等方面均具有重要意义。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)属于核内激素受体家族成员，也是一种转录因子，PPARγ在细胞的转录调控过程起重要作用。解偶联蛋白2(UCP2)是解偶联蛋白家族的一员，在1997年被发现，是一种位于线粒体内膜上的载体蛋白，起质子通道作用，该基因区与肥胖有关。
本实验研究结果显示，随着造模时间的延长，高脂饮食使实验动物的脂肪肝程度逐渐加剧。RT-PCR结果表明脂肪变的肝脏组织中PPARγ mRNA及UCP2 mRNA表达逐渐增强。这与国内外其他学者的研究一致。Nakamuta等学者选择12名NAFLD患者，并进行肝组织活检，RT-PCR分析各种基因表达情况，发现肝组织中PPARγ表达增强[1]。国内范建高等学者发现高脂饮食性非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏PPARγ表达增强[2]。国内也有不同的学者分别用高脂饮食诱导大鼠NASH模型，结果均发现肝脏组织中UCP2表达明显升高[4、7]。提示在NAFLD中PPARγ、UCP2基因表达含量均显著增加，它们可能参与了NAFLD的病理过程，是NAFLD的一种适应性机制。
罗格列酮对PPARγ及UCP2表达的影响各家报道不一，且迄今为止直接在体研究罗格列酮对脂肪肝组织中PPARγ、UCP2表达的影响尚未见报道。
王开成[8]等实验显示罗格列酮提高胰岛素抵抗大鼠大网膜脂肪细胞PPARγ mRNA的表达水平。但是也有其他学者持不同的研究结果。刘章锁等[9]用罗格列酮干预糖尿病大鼠8周，可抑制糖尿病肾病状态下肾脏内PPARγ的表达上调。熊祖应等[10]用白介素1-β制备炎性人系膜细胞模型，蛋白印记法和RT-PCR检测发现模型组PPARγ mRNA和蛋白水平迅速增高。曲格列酮则以剂量依赖性方式下调PPARγ mRNA和蛋白的表达。
TZDs对UCP2表达的影响主要见于离体细胞的研究，且结果也不一致。目前尚未见有罗格列酮对非酒精性脂肪肝组织中UCP2表达的影响的相关报道。Strobel[11]的研究显示噻唑烷二酮类能显著增加人PAZ6脂肪细胞中UCP2表达，但是UCP2表达的增加与脂肪细胞分化标记蛋白表达的增加并行。在Tian等[12]的一项研究中发现，将离体的胰岛细胞培养于高浓度的软脂酸盐培养基48 h后可见胰岛细胞UCP2 mRNA水平增加，而在以上培养基中加入罗格列酮后可下调胰岛细胞UCP2表达2 ......
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