重组人血管内皮抑制素冻干粉针剂的研制和质量评价(2)
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1-分子量标准；2-理化对照品；3-冻干粉
试验结果如图3所示，随着药品浓度的增加，OD值逐渐降低，说明增殖的细胞数量逐渐减少。经计算，活性标准品EC50为76.027，供试品EC50为77.465，供试品的生物学活性为每毫升8×104U/支，即每支2.4×105U，符合要求(标准为每支1.2×105U~4.8×105U)。
2.4 等电点分析
等电聚焦电泳按照《中国药典》[5]进行，理化对照品和供试品加样量均为15 μl。Endostar冻干粉等电点主区带在8.8~9.8之间，与理化对照品一致(图4)。
2.5 肽图分析
将理化对照品和冻干粉分别用纯化水稀释至浓度1 mg/ml，然后在1% NH4HCO3溶液中透析8 h，按胰蛋白酶∶蛋白=1∶50(mg/mg)分别加入胰蛋白酶，37℃保温24 h后，用HPLC法对样品进行分析。流动相A液为含0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱70 min(A液从100~30%，B液从0~70%)，流速为1.0 ml/min，检测波长为214 nm，进样量100 μl。结果显示，endostar冻干粉用胰蛋白酶消化后，裂解图谱与理化对照品裂解谱图一致(图5)。
2.6 其他项目分析
参照《中国药典》[5]的要求和方法对Endostar冻干粉针剂进行了其他项目的检定。外观为白色疏松体，加入3 ml注射用水后迅速复溶为澄明液体。水分 < 3.0 %，pH值为5.0~6.0，均符合规定。鉴别实验、可见异物、无菌检查、家兔热源、小鼠异常毒性实验均符合要求。
3 讨论
预实验曾筛选了不同的辅料作为冻干保护剂，最终确定采用4 %甘露醇、2 %蔗糖、30 mm乙酸钠，该处方能有效保持Endostar药物的活性。图1和图2显示，Endostar按照本文所述工艺冻干后，没有降解物和聚合体的产生。Endostar冻干粉复溶后要求pH值为5.0~6.0，但在冻干处方中采用pH值为4.5，主要是因为在冻干过程中，乙酸钠的乙酸根部分挥发，冻干后会造成pH值上升。
目前国内外市场上，Endostar药物上市的剂型仅有水针剂，药物有效期为18个月，冻干粉针剂的研制成功，将更加有利于endostar药物的稳定性，有望延长endostar药物的有效期。
参 考 文 献
[1] O Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogengsis and tumor growth. Cell, 1997, 88 (2):277-285. ......
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