白蛋白纳米基因载体的制备与表征(2)
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2.3 单个变量改变对白蛋白纳米粒表征的影响 ①一定范围内，搅拌速度越快，粒径相对越小；pH越接近等电点，粒径相对增大，越不容易形成纳米粒；搅拌时间越长，交联越充分，粒径相对较大，当达到完全交联后，即使再延长搅拌时间，粒径不会再增大。②搅拌一般不会引起电荷变化，盐酸调整pH时解离后电荷相抵消，pH距离等电点越远，所带净电荷数越多。
2.4 白蛋白纳米溶液稳定性考察 白蛋白纳米溶液室温下静置保存10 d后，白蛋白纳米粒的粒径有所增大，电荷也有所衰减，但变化幅度都比较小，PDI无明显变化，性质相对较稳定。
2.5 PicoGreen法测得结果经公式计算基因转载率 (97.61±0.06)%。
2.6 流式细胞仪检测 pSEA-HSA-NPs、pSEA 和 pSEA-LipofectamineTM 2000 组 48 h 转染率分别为(48.21±5.94)%、(0.72±0.26)%和(21.36±3.80)%。
2.7 不同的载体转染效率对比结果(图1)：
3 讨论
人血清白蛋白A1653的等电点为4.7，在pH值为6.9时, 白蛋白表面携带负电荷，同时白蛋白纳米溶液的zeta电位也表明白蛋白纳米粒表面携带负电荷。当向白蛋白纳米溶液中加入pDNA后，白蛋白和pDNA表面均携带负电荷，可能不利于二者结合，但pDNA的带电量很小，去溶剂化过程采取一步法制备携带目的基因的白蛋白纳米粒，pDNA则因戊二醛的醛基与白蛋白的氨基之间强烈的缩合反应(共价键的形成)，同性电荷之间的斥力几乎可以忽略不计， 库仑力(反比于距离的平方)也只有在很接近时才表现出明显的斥力，而白蛋白纳米粒的粒径很小，表面积很大，巨大的表面积可以显著增强白蛋白纳米粒的囊化作用。pDNA同时也可以部分交联或共价结合在白蛋白纳米粒的表面。电荷作用的综合效应使携带目的基因的白蛋白纳米粒携带负电荷，研究表明阴离子纳米粒比阳离子纳米粒更容易扩散，而负电荷能维持基因投递[11]。
此外，白蛋白和戊二醛的比例决定着白蛋白纳米的交联度，我们选择了40%的戊二醛浓度(形成稳定纳米粒的必要条件)[12]，人血清白蛋白与戊二醛的比例为1∶0.1，可获得较高的交联度，高度交联能提升质粒俘获。同时，zeta电位的绝对值愈大者载药量也愈大，我们制备的白蛋白纳米粒溶液的zeta电位绝对值大于30.0 mV，当向白蛋白纳米溶液中继续引入带负电荷的pDNA后，一方面溶液的zeta电位绝对值会继续大，能维持良好的基因携载能力，另一方面向溶液中引入负电荷也会增加白蛋白之间的斥力，减少白蛋白与戊二醛之间的交联，使粒径变小，更有利于目的基因的转染。
我们采取去溶剂化法制备白蛋白纳米基因载体，未引入对质粒DNA有损伤的物理及化学损伤因素，制得的白蛋白纳米基因载体的粒径大小、zeta电位及基因转载率均显示白蛋白纳米载体满足纳米基因载体的要求，能够用作二次基因载体。携带超抗原SEA基因的白蛋白纳米载体基因转染率及转染效率(图1)明显高于LipofectamineTM 2000，表明白蛋白纳米载体满足高效基因转染的要求，将在肿瘤防治方面发挥重要作用。
参 考 文 献
[1] Mo Y, Barnett ME, Takemoto D, et al.Human serum albumin nanoparticles for efficient delivery of Cu, Zn superoxide dismutase gene. Mol Vis, 2007, 23:746-757.
[2] 张德阳,郭研,刘蔚东,等.用白蛋白纳米粒做基因载体的体外研究.中华实验外科杂志，2004, 21:1456-1458.
[3] Lu W, Zhang Y, Tan YZ, et al.Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles as novel drug carrier for brain delivery. J Control Release,2005, 107:428-448.
[4] Lu W, Sun Q, Wan J, et al.Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res,2006, 66:11878-11887.
[5] Davda J, Labhasetwar V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells. Int J Pharm, 2002, 233:51-59.
[6] Wartlick H, Spnkuch-Schmitt B, Strebhardt K, et al.Tumour cell delivery of antisense oligonucleotides by human serum albumin nanoparticles ......
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