丹参酮ⅡA对鼠肝星状细胞活化Ca2+效应的抑制作用(2)
 |
| 第1页 |
 |
| 第7页 |
参见附件。
1.8.3 LSCM检测 HSCs[Ca2+]i 将上述经制备的动物血清预处理的细胞负载好 Fluo-3/AM后上机检测,每组相同位置选取8个细胞进行荧光强度分析。
1.8.4 AngⅡ刺激后LSCM检测 HSCs[Ca2+]i 将上述经药物血清预处理的细胞及对照组细胞负载好Fluo-3/AM后上机检测,给予AngⅡ(10-7mmol/ L)刺激后分析细胞荧光强度变化百分数。
HSCs胞浆[Ca2+]i 的计算方法:利用LSCM所配备的计算与图像软件(leica confocal software,TCS SP2),计算荧光强度相对值,荧光强度越大, [Ca2+]i越高; [Ca2+]i的变化用Fluo-3/AM与 Ca2+结合后荧光强度变化百分数表示。
[Ca2+]i荧光强度变化百分数(%) = (F-F0)/F0×100%
其中 F为LSCM测量时整个细胞的平均荧光强度,F0 为用药前的[Ca2+]i 荧光强度。
1.9 统计学处理
结果以均值±标准差(x±s)表示,采用 SPSS 10.0软件行单因素方差分析。
2 结果
2.1 HSCs的 Ca2+荧光成像 LSCM下 Ca2+成像的 HSCs仍可见普通倒置显微镜下的形态特征,细胞内[Ca2+]i 的浓度的高低由细胞被激发出的荧光强弱表示,荧光强度越强表示[Ca2+]i 浓度越高,反之则越低。本实验 HSCs与Fluo-3/AM孵育后,所有细胞均被染色,且每组各细胞间的强度基本一致。
2.2 静息状态下 HSCs[Ca2+]i 的动态变化
为证明细胞培养液本身对 HSCs[Ca2+]i的影响,本研究观察了6个 HSCs在实验所需的时间内(5 min) [Ca2+]i的动态变化。结果表明,HSCs在实验所需的整个时间内[Ca2+]i 荧光强度基本保持稳定。
2.3 不同浓度AngⅡ对 HSCs的累积反应曲线
给予AngⅡ浓度梯度刺激 HSCs后, [Ca2+]i 荧光强度逐渐增加,作出累积反应曲线后,得到EC50值约为1.1×10-7mol/L。
2.4 丹参酮ⅡA药物血清对 Ang Ⅱ介导的 HSCs[Ca2+]i变化的影响
①经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组药物血清预处理 HSCs后,其[Ca2+]i荧光强度相对值均显著低于经肝纤维化模型对照组血清预处理的 HSCs[Ca2+]i (均为 P<0.05);且两者与正常大鼠对照组相比也均差异有统计学意义(均为 P<0.05)。②经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组药物血清预处理HSCs后,给予AngⅡ(1.1×10-7mol/L)刺激 HSCs,其[Ca2+]i荧光强度变化百分数均显著低于正常对照组及肝纤维化模型对照组(均为 P<0.01),见表1。
3 讨论
肝星状细胞(HSCs)位于肝窦Disse间隙，约占肝细胞总数的13%，与肝细胞及肝窦内皮细胞直接接。HSC正常情况下处于静息状态，主要功能是参与维生素A的代谢和储存脂肪[1]。1985年Friedman等[2]首次报道这种贮脂细胞是生成胶原的主要细胞，之后大量研究开始关注其在肝纤维化进程中的作用，并取得很大进展，调控HSCs活化的关键信号通路基本得以阐明。研究发现，在病毒、乙醇等慢性损伤因素作用下，肝细胞、窦内皮细胞、Kupffer细胞、炎症细胞等通过旁分泌途径，激活的HSCs也可通过自分泌途径，产生TGFβ1、血小板衍生生长因子(PDGF)等多种细胞因子，激活HSCs，促进其增殖、合成大量ECM，同时ECM降解减少，以致其在肝内大量沉积，肝纤维化逐渐形成[3]。目前普遍认为，HSCs的活化和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节[4]。因此，在有效去除病因的基础上，抑制HSCs活化和增殖或诱导其凋亡是目前治疗肝纤维化的主要策略。
丹参为唇形科鼠尾草属植物的干燥根部,为常用中药,有活血祛瘀，安神宁心，止痛等功效,其药理及临床应用范围较广,已证实丹参能抑制HSCs活化[Ca2+]i的升高[5],其脂溶性部分有效成分丹参酮IIA已被证明具有抗氧化性、抗急性肝损伤和抗肝纤维化等作用[6-8]。在细胞内Ca2+浓度的增加是细胞增殖分裂不可缺少的条件。在HSCs活化过程中,其胞质内的[Ca2+]i是许多生长因子、细胞因子及氧化应激产物等发挥促生长和增殖作用的主要递质之一。本实验研究丹参酮IIA是否能够通过抑制HSCs活化[Ca2+]i的升高，发挥抗肝纤维化作用。
Batller用体外研究125I AngⅡ结合试验表明, 激活的人HSCs有大量血管紧张素 Ⅱ1型受体 (AT1) 的表达[9]。提示激活的 HSCs是肝内脉管系统 AngⅡ的重要靶器官。AngⅡ作用于 HSCs的 AT1受体, 可引起细胞内钙明显增加, 进而经过ERK等途径作用于转录因子 AP-1等, 最终引起 HSCs活化与增殖。本实验结果显示, 给予 Ang Ⅱ 刺激后, 经两种丹参酮IIA药物血清预处理的 HSCs其 [Ca2+] i荧光强度变化百分数明显低于病理模型对照组及正常对照组, 提示丹参酮IIA阻断或抑制了 HSCs的 Ang -Ⅱ信号转导通路, 从而抑制 HSCs的活化与增殖。
本实验结果表明,经正常大鼠及肝纤维化大鼠分别制备的两种丹参酮IIA药物血清预处理后,其钙荧光强度均明显低于肝纤维化模型对照组及正常对照组,显示两种丹参酮IIA药物血清均显著抑制了HSCs细胞内钙的升高。该结果提示, 丹参酮IIA可能通过抑制HSCs[Ca2+]i的升高,从而抑制的HSCs活化与增殖,此可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。当然, HSCs的活化增殖是由极其复杂的信号转导网络所调控,关于丹参酮IIA抑制钙动员的作用机制尚需进一步深入研究。
参 考 文 献
[1] Friedman SL. Hepatic stellate cells. Prog Liver Dis, 1996, 14:101-130 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(5696kb)。