生殖器疱疹患者超氧化物歧化酶活力及自然杀伤细胞表达的检测
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【摘要】 目的 研究生殖器疱疹患者氧化应激状态与细胞免疫水平。方法 收集24例生殖器疱疹患者和24例正常对照者的血清，采用透射比浊法测定超氧化物歧化酶的活力，流式细胞仪检测外周血自然杀伤细胞的表达水平。结果 生殖器疱疹患者超氧化物歧化酶活力明显低于正常对照者(t=-4.14, P=0.0001)，自然杀伤细胞的表达水平明显低于正常对照组(t=-2.67, P=0.0133)，患者超氧化物歧化酶活力与自然杀伤细胞的表达水平无显著相关性(r=-0.02566, P= 0.9170)。结论 生殖器疱疹患者存在氧化应激状态失衡，免疫功能低下。
【关键词】
生殖器疱疹;超氧化物歧化酶; 自然杀伤细胞
生殖器疱疹(genital herpes, GH)是常见的性传播疾病之一，由I型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus type 1，HSV-1)或Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)引起的一种性传播疾病，临床主要由HSV-2感染引起[1]。GH发病率逐年增高，易反复发作，给患者和社会带来沉重的心理和经济负担[1,2]。GH的发病机制尚未完全清楚，有研究显示HSV病毒感染机体后，引发机体的细胞免疫紊乱及氧化应激状态失衡，主要是T细胞水平表达低下、Th细胞及Tc细胞分化偏态[2,3]。本研究探讨GH患者氧化应激状态与细胞免疫水平，以探讨GH的发病机制，可用于指导GH的治疗、判断预后。
1 资料与方法
1.1 临床资料 收集24例GH患者，所有患者来自我院2010年8月至2011年1月性病科门诊，诊断符合2000年我国卫生部疾病控制司和全国性病麻风病控制中心联合颁布的GH诊断标准。24例GH患者中男16例，女8例，年龄18～40岁(平均23.6岁)，病程2 d～2年，平均病程10.1个月。患者就诊前3个月内均未系统性应用免疫抑制剂、免疫调节剂、皮质类固醇制剂。收集24例健康体检者作为正常对照，其中男14例，女10例，年龄18～36岁(平均22.9岁)，患者与健康对照者年龄、性别差异无统计学意义。
1.2 实验方法
1.2.1 SOD的检测 早晨空腹肘静脉取血2 ml, 分离血清待测。采用透射比浊法, SOD 标准试剂合由南京建成生物研究所提供, 检测方法参照试剂说明书和文献进行[3]。
1.2.2 NK细胞表达的流式细胞术分析 取GH患者肝素抗凝血100 ul，加入淋巴细胞检测试剂25 ul，混匀，室温避光染色20 min；加入2 ml红细胞裂解液，室温避光放置10 min； 1500 r/min离心5 min弃上清液，加磷酸盐缓冲液(PBS)2 ml，混匀；1500 r/min离心5 min弃上清液，加2%多聚甲醛PBS 500 ml固定，放置4℃~8℃冰箱待检测。每管加细胞液100 μl，加入10 μl抗CD4 mAb-PerCP,温室避光放置15 min;红细胞溶解液0.5 μl溶解红细胞15 min; 破膜剂I、II固定和破膜；加PBS3 ml，1200 r/min离心5 min，弃上清；加细胞因子抗体，每份标本分别加同型对照IgG1-FITC；温室避光放置15 min；加PBS 4 ml，1200r/min；离心10 min，弃上清；适量PBS重悬细胞上流式细胞仪检测；每份标本检测1万个细胞结果经Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。
1.3 统计学方法 采用SAS 8.01 统计软件进行统计学分析，组间比较方差分析后采用t检验，以P<0.05具有统计学意义。
2 结果
GH患者SOD活力明显低于健康对照组(t=-4.14, P=0.0001)；NK细胞的水平明显低于健康对照组(t=-2.67, P=0.0133)(见表1)；SOD活力与NK细胞表达无显著相关性(r=-0.02566, P= 0.9170)。
3 讨论
SOD 是组织细胞中清除自由基的主要预防系统, 活力反映了机体清除氧自由基的能力, 对有害的超氧阴离子自由基产生特异的歧化反应, 阻止自由基攻击核酸、蛋白质、不饱和脂肪酸等生物大分子, 使之发生交联或断裂, 保护细胞免于损伤[4,5]。SOD 与产生的自由基发生歧化反应, 保护组织细胞免受损伤; 而信息蛋白迅速传递信息, 反馈到控制SOD 表达的基因快速作出应答, 产生足量的SOD,以满足组织细胞代谢的需要,当这种异常的应答一旦长时间的存在下去, 必然要导致组织细胞内代谢失去平衡, 导致细胞发生异变。NK细胞是机体免疫系统的重要免疫细胞，是抗病毒感染的第一道防线[4,5]。在免疫过程中，NK细胞的存在决定着细胞毒性T淋巴细胞体细胞向成熟细胞毒性T淋巴细胞的分化并且控制着记忆T细胞的形成。MHC-I 类分子将感染HSV的细胞首先呈递给NK细胞，NK细胞直接而迅速地杀灭病毒[2]。最近的研究显示GH患者外周血NK细胞数量减少；此外，患者皮损内HSV-2病毒载量与NK细胞水平呈显著的负相关[6], 提示NK细胞活性减低,抗病毒作用减弱,抑制T淋巴细胞的增殖。癌症患者NK 细胞活性降低, SOD与过氧化氢酶协同能够恢复患者的NK细胞活性[7]。
本研究旨在探讨GH患者SOD与过氧化氢酶协同能否恢复患者的NK细胞活性，提高患者的免疫水平。研究结果显示，GH患者外周血中SOD活力明显减低，可能与HSV感染消耗了抗氧化物SOD, 造成了机体的氧化应激失衡。GH患者NK细胞数量明显低于正常人群，但SOD活力与NK细胞数无显著相关性，可能与HSV病毒感染属于局限性，未引起全身性炎症反应有关，本研究结果与易勤等人[7]报道的结果基本一致。提示GH患者存在氧化应激状态失衡、细胞免疫抑制，抗病毒作用减弱现象；在治疗上除了给予抗病毒治疗, 同时给予免疫增强剂和抗氧化剂能有效地降低GH的复发率 ......
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