筛选糖尿病候选药物FGF-21受体激动剂的新型细胞模型的建立
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【摘要】目的建立了成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的药物筛选模型，用于FGF-21受体激动剂药物的筛选。方法本研究将P klotho基因采用分子克隆技术构建了pBMN-IRES-EGFP病毒载体，包装病毒并感染3T3-L1细胞株，通过筛选得到了能够稳定表达P klotho细胞。结果构建的筛选模型可以筛选FGF-21及其受体的药物。结论该筛选模型的构建为治疗糖尿病药物的研发提供了新的前景。
【关键词】FGF-21；药物筛选；糖尿病药物
糖尿病是临床常见的代谢性疾病，全球糖尿病患者的数量已经达到了2亿以上，其中2型糖尿病患者的比例约占90%[1]。2型糖尿病的发病机理相当复杂，目前治疗主要通过药物作用胰岛β细胞或者改善胰岛素的敏感性进行治疗。但是以上疗法疗效低且伴有明显的不良反应。FGF-21在血糖控制方面具有重要作用，目前FGF-21是临床筛选新型降血糖的新药物。FGF-21的生物学作用与传统FGF家族信号通路不同，其不与FGFR之间特异性结合，FGF-21则与p klotho转膜蛋白相互作用来调节脂肪细胞对葡萄糖的吸收[2]。本研究以FGF-21信号通路作为靶点，建立了糖尿病新药筛选的模型。
1材料与方法
1.1pBMN-p klotho-IRES-EGFP病毒载体本研究根据pklotho基因设计引物，PCR扩增p klotho基因，PCR反应条件如下：98 ℃预变性5 min, 98 ℃变性1 min, 55 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸1 min,循环30次,72 ℃延伸 7 min, 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。将pBMN-IRES-EGFP 载体与PCR扩增产物采用 SacII 和 EcoRI进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶将载体和目的片段酶连，得到pBMN-p klotho-IRES-EGFP载体[3]。转化DH5α在氨苄LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆小提质粒进行双酶切鉴定，阳性克隆进行测序鉴定。测序正确者采用质粒大提试剂盒提取质粒，用于病毒包装。
1.2病毒收集和包装293E细胞用10%FBS+DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养，待细胞生长到状态良好后接种于6孔板，当细胞生长至85%时，用Lipofectamine 2000将重组质粒 pBMN-p klotho-IRES-EGFP 载体转染293E细胞，具体步骤根据说明书进行，转染8 h后更换新鲜培养基，36 h后收集培养上清，0.45 μm滤膜对病毒上清液进行过滤。NIH3T3 细胞分别接种于6孔板，细胞贴壁后将上清液弃掉，然后加逆转录病毒上清液0.5 ml,置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h，然后将细胞消化，同时以未感染的细胞作为阴性对照，细胞用PBS洗3遍，重悬于500 μlPBS中；采用流式细胞对阳性细胞百分比进行分析，并对病毒的滴度进行计算。
1.3稳定细胞系的构建在上述的具有较高滴度的病毒上清液中加入polybrene，使其终浓度为5 μg/ml。3T3-L1前体脂肪细胞接种于6孔板，生长至指数生长期后，加入上述液体感染，置于细胞培养箱中培养，连续感染4 d。结束后用胰酶消化细胞，并采用流式细胞术进行分选。为了得到能够稳定表达P klotho的3T3-L1稳定细胞系，流式分选时应保持无菌条件，每6 d再次筛选，直到得到稳定细胞系为止。
1.4葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法分析上述构建的稳定3T3-L1-pP klotho细胞在无血清培养基中培养12 h，细胞用人源的不同浓度的FGF-21和人重组胰岛素(1、10、100及1 000 nmol L-1)处理细胞24 h，对培养上清中的葡萄糖含量进行测定。设立三个复孔。
2结果
2.1重组pBMN-p klotho-IRES-EGFP 的鉴定本研究根据GenBank提供的序列设计引物，以P klotho 基因的质粒为模板扩增出了与预期分子量大小一致的基因片段。然后将pBMN-IRES-EGFP病毒载体与PCR产物进行双酶切，酶连转化DH5a，在抗生素平板上筛选，生长的克隆提取质粒进行双酶切鉴定，阳性克隆送基因公司进行测序，测序结果显示PCR产物与GenBank提供的基因序列相同。
2.2病毒滴度的测定和稳定细胞系构建逆转录病毒上清液0.5 ml感染NIH3T3细胞，感染48 h后消化细胞进行流式细胞术分析，并计算病毒滴度，结果显示病毒的滴度为8×109。将获得的新鲜的缺陷性病毒上清感染3T3-L1脂肪细胞，经过多轮筛选后得到了稳定表达p klotho细胞系。
2.3FGF-21与人重组胰岛素介导3T3-L1-p klotho细胞的活性检测用不同浓度梯度的FGF-21与胰岛素处理3T3-L1细胞和3T3-Ll-p klotho稳定细胞系24 h，对不同浓度下的葡萄糖消耗量进行检测，结果如表1所示，FGF-21和胰岛素对3T3-L1细胞葡萄糖消耗没有影响，而对3T3-Ll-p klotho稳定细胞系的葡萄糖消耗呈现浓度依赖性的促进作用。当FGF-21与胰岛素的浓度达到1 000 nmol L-1时，葡萄糖的消耗率最高。
表1不同浓度梯度的FGF-21与胰岛素对葡萄糖的消耗分析
组别3T3-L1细胞(%)3T3-Ll-p klotho稳定细胞系(%)11010010001101001000FGF-2115.4±1.216.3±2.016.9±2.317.0±2.135.5±3.544.3±4.254.7±3.563.6±3.9胰岛素20.1±3.422.1±3.019.8±3.521.1±4.230.5±2.339.4±4.243.5±3.253.2±2.8
作者单位：457001河南省濮阳市油田总医院药剂科3讨论
FGF-21是由肝细胞分泌的一种多肽，其具有不依赖葡萄糖而促进糖的吸收的作用[4]。目前，关于FGF-21的分子机制研究较少，但是现已研究显示其在调节血糖方面具有重要的作用，暗示其可能在糖尿病方面意义重大。由于FGF-21与其受体P klotho 结合发挥作用，本研究以P klotho作为靶点建立了糖尿病药物筛选模型[5]。
本研究以3T3-L1细胞为基础，采用逆转率病毒将P klotho整合到3T3-L1细胞的基因组上，最终筛选出了稳定表达p klotho受体的细胞株。同时通过FGF-21与胰岛素处理测定了该细胞对葡萄糖的吸收 ......
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