人脐带间充质干细胞对急性肺损伤氧化应激的影响(2)
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1.2 方法
1.2.1 大鼠急性肺损伤造模 LPS模型组：10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔内注射麻醉大鼠,气道内滴注LPS 5 mg/kg。ALl模型复制成功后观察大鼠可见口唇灰紫，麻醉苏醒后精神萎靡，呼吸频率明显加快，活动减少,皮毛耸立。
1.2.2 病理学观察 左肺组织以10%多聚甲醛浸泡48 h，脱水、石蜡包埋，切片，用苏木精伊红(HE)染色后，光镜下观察。
1.2.3 肺湿/干重比测定 各组大鼠开胸取右肺中叶，滤纸吸干，称取湿重(W),置70℃恒温箱48 h,烘干至恒重，称取干重(D),计算肺组织湿重/干重(W/D)。
1.2.4 肺组织匀浆中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定
剩余肺组织制备组织匀浆，硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活性,具体步骤按试剂盒说明书进行。
1.2.5 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行分析，数据以(x±s)表示，各组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HUMSCs的细胞形态及流式细胞仪 表面标志物鉴定结果：倒置显微镜下观察HUMSCs呈贴壁生长，形态为梭形，为典型的成纤维细胞形态。流式细胞仪鉴定纺锤样细胞高表达CD29、CD44和CD105，几乎不表达造血系标志CD34，符合HUMSCs的特征，细胞纯度符合实验要求。
2.2 肺组织形态学观察 对照组肺组织结构正常，肺泡结构完整清晰。LPS模型组肺组织水肿，少量出血，光镜下观察可见大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚，局灶性肺不张，上述病理形态学改变符合ALI表现。干细胞移植组肺损伤程度较模型组明显减轻。
2.3 肺W/D比 与对照组比较，模型组肺W/D比明显增加(P<0.05)。与模型组比较，干细胞移植组肺W/D比明显降低 (P<0.05),差异有统计学意义。见表1。
2.4 各组大鼠肺组织中MDA和SOD测定 各组大鼠肺组织MDA和SOD含量的测定结果见表1。由表1 可见，与A组比较，B组肺组织MDA含量明显升高(P<0.05);与B组相比,C组MDA含量明显降低(P<0.05), 差异有统计学意义。与A相比，B组SOD活性明显降低(P<0.05);与B组相比，C组SOD活性明显升高(P<0.05)，差异有统计学意义。
表1
各组大鼠肺组织W/D比和MDA、SOD的结果(x±s)
组别W/DMDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)
A组4.83 ±0.113.07±0.2830.08±2.56
B组5.43 ±0.10*8.30±1.09*17.91±3.89*
C组5.09 ±0.11#6.81±0.95#23.05±3.87#
注：*与A组比较P<0.05，#与B组比较P<0.05
3 讨论
ALI是临床各科常见的危重急症，也是创伤、感染、休克及刺激性气体中毒等最严重的后果。其发病机制至今尚未完全阐明。除爆发式炎症反应外，另一重要因素是氧化应激反应加强，氧自由基生成增加而清除减少，氧化程度超出氧化物的清除，使氧化与抗氧化系统平衡失调，从而导致组织损伤。我们采用静脉注射LPS的方法复制大鼠化学性ALI模型,模拟临床上ALI的病理生理过程。结果显示，模型组注射LPS后6h末，肺湿/干重与对照组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。病理学检查出现水肿，炎性渗出等变化，提示肺泡毛细血管膜损伤，肺血管壁通透性增强。上述结果表明LPS型ALI模型复制成功。
干细胞研究是当今生命科学研究的热点之一。HUMSCs作为一种多能干细胞，与其他来源的MSCs相比，具有来源广泛、易于采集和保存、无异体排斥、无伦理争议等诸多优点[7]。已应用于大量疾病研究当中，如治疗乳腺癌[8]、肺纤维化[9]和帕金森病[10]。HUMSCs是目前最有应用前景的种子细胞。最近的研究证实,MSCs的这种作用是一种旁分泌效应, 表现为短暂性的释放抗炎症因子, 刺激了内源性的修复, 而不是移植的MSCs再生或者分化后修复了损伤组织。
人体在代谢过程中产生多种自由基，发挥解毒、 清除病原微生物及参与生物合成等生理作用。但在病理状态下，自由基产生和清除失控，过量的自由基则作为致病因子损伤组织和细胞。MDA是检测体内脂质过氧化程度的客观指标，而SOD含量高低间接反映机体清除氧自由基的能力。实验结果显示,B组注射LPS后6h产生了明显的肺损伤，同时机体抗氧化应激能力显著下降。B组肺组织中MDA含量显著高于A组，肺组织内SOD活性显著低于A组。说明LPS所致的肺损伤使肺部发生了强烈的氧化应激。强烈的氧化应激不仅可直接损伤肺泡上皮及肺泡毛细血管内皮细胞，还可通过肺部脂质过氧化反应产生新的氧自由基以多种方式参与肺泡毛细血管内皮细胞的损伤，导致肺损伤。正常情况下，机体抗氧化系统可以清除过多的氧自由基，使机体不会被氧自由基损伤；而LPS损伤时，肺部发生强烈的氧化应激，机体抗氧化应激能力不足，说明二者的失衡参与了肺损伤。本研究证明HUMSCs能一定程度上控制这种氧化应激。这与Araceli等[11]在试管内hMSCs能清除活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，并能有效地控制氧化应激的研究是一致的。Simta等[12]的研究也已经证实在活体内注射BMDMSC能改善内毒素诱导的小鼠急性肺损伤模型组织中的氧化还原状态。
综上所述，HUMSCs能显著改善LPS诱导的大鼠ALI肺组织病理学改变及肺损伤程度 ......
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