鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠痛阈的影响(2)
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1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 反义寡聚核苷酸以大鼠Cav3基因序列为基础设计，由上海生工合成[2]，序列如下：Cav3.3反义寡聚核苷酸5 GCT GAG GGC GGC TTG TGT TT3，错义寡聚核苷酸作为反义寡聚核苷酸处理的对照组，序列如下：5TAC TGT ACT TGC GAG GCC AC3，使用前用生理盐水稀释。抗Cav3.3抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根酶标记兔抗山羊IgG和DAB试剂盒购自北京中山公司。von Frey纤维丝和热痛刺激仪BME410A分别购自美国Stolting公司和中国医学科学院生物工程研究所。
1.2 实验动物与分组 健康成年雄性SpragueDawley大鼠48只，体重250～280 g,由徐州医学院实验动物中心提供。行为学实验包括32只大鼠，随机分为4组(n=8)，即CCD+NS组：鞘内注射生理盐水；CCD+Cav3.3AS组：鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸； CCD+ Cav3.3MM组：鞘内注射Cav3.3错义寡聚核苷酸；sham+NS组：鞘内注射生理盐水。各组大鼠在鞘内置管成功后5 d行CCD手术或sham手术，术后第1天起，连续4 d每天两次，鞘内分别注射12.5 μg，容积均为10 μl的反义、错义寡聚核苷酸或10 μl生理盐水。分子生物学western blot实验每组4只(n=4)。
1.3 CCD模型的建立 参照胡三觉等[3]方法。SD大鼠在1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉后，沿 L4～6棘突右侧切皮，分离脊椎右侧肌肉，暴露L4～6横突及其间的椎间孔，用弯成直角的长4 mm，直径0.7 mm的钢棒，以与背部正中线成30度以及与脊柱侧面水平线成10度向头背端插入L4和L5椎间孔(深度约3～4 mm)。假手术组(sham)仅暴露L4、L5横突和椎间孔，不插入钢棒。
1.4 鞘内置管 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥40 mg/kg麻醉，采用Yaksh法[4]，行鞘内置管术，大鼠清醒24 h后观察其活动情况，剔除出现运动功能障碍的大鼠不用。术后第3天用2%利多卡因10 μ l经导管注射来判断导管的位置，如注射后30 s内大鼠出现双后肢麻痹说明导管位置正确。5 d后即可用于实验。实验时每次给药后用10 μl生理盐水冲洗PE管。
1.5 行为学测定 用von Frey细丝测定大鼠的机械性缩足阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)，用热辐射法测定大鼠热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。各组大鼠在手术前两天测定基础痛阈及手术后1至14 dMWT和TWL ......
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