食管鳞癌组织中Netrin—1蛋白及mRNA的表达(1)
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【摘要】 目的 检测食管鳞癌组织中神经轴突导向因子(Netrin—1)及mRNA表达。方法 应用免疫组化SP法和原位杂交方法检测50例食管鳞癌组织及其相应的19例癌旁不典型增生组织和20例正常食管黏膜组织中Netrin—1、mRNA的表达。结果 ①食管鳞癌组织中Netrin—1、mRNA阳性表达率均高于癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织(P均<0.05)。②有淋巴结转移组食管鳞癌组织中Netrin—1、mRNA阳性表达率均高于无淋巴结转移组(P均<0.05)。结论 人食管鳞癌组织中Netrin—1蛋白及mRNA均呈高表达，可能参与食管癌的发生、发展。
【关键词】 食管鳞癌；神经轴突导向因子
Netrin家族是一类与层黏连蛋白相关的可分泌蛋白，是重要的神经突起导向因子，在结构上高度保守[1]。Netrin—1是Netrin基因家族中研究较多的重要成员之一。近年来研究结果显示，Netrin—1可通过调节肿瘤血管生成调节肿瘤的形态发生和发展、转移。有关食管鳞癌组织中Netrin—1、mRNA表达及其意义尚未见文献报道。作者采用免疫组化与原位杂交方法观察食管鳞癌组织中Netrin—1、mRNA表达，从而探讨其与食管癌发生发展及浸润转移的关系。
1 材料与方法
1.1 实验标本 组织标本系河南省商丘市第一人民医院和商丘市第三人民医院2011年3月至2012年3月食管癌新鲜手术切除标本，共50例，病理证实均为鳞癌，并取相应的癌旁不典型增生标本19例及正常食管黏膜标本20例。食管鳞癌患者中男30例，女20例，年龄38～76岁。50例食管标本按有无淋巴结转移分为：转移组14例和无转移组36例。术前均未接受放化疗。
1.2 实验试剂 Netrin—1免疫组化SP试剂盒及Netrin—1原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Netrin—1兔抗人抗体购买于北京中杉试剂公司；胃蛋白酶、预杂交液及核固红均购自武汉博士德生物工程有限公司；SP—AP(Streptavidin A1一kaline Phosphatase)及BCIP/NBT购自美国Promega公司，Netrin—1探针(5—GGAAGTTCACGGTGAACAT—3)，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。
1.3 方法
1.3.1 标本处理 食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织经40 g/L的多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组化及原位杂交检测。
1.3.2 免疫组织化学 免疫组化SP法染色步骤按照试剂盒及一抗(浓度为1∶ 100)说明书要求进行，同时用购自武汉博士德公司(Netrin—1)的阳性对照片进行阳性对照及用PBS代替一抗作阴性对照。
1.3.3 原位杂交 参照原位杂交试剂盒说明书操作，以不含探针的预杂交液进行杂交及杂交前用RNase处理样本作阴性对照。
1.3.4 免疫组化及原位杂交结果判定 在显微镜下观察并计数，每张切片观察10个视野(200×)，并取均数。按阳性细胞数所占的百分比分为：阴性，阳性细胞数<5%；弱阳性，阳性细胞数占5%～25%；阳性，阳性细胞数占25%～50%；强阳性，阳性细胞数>50%。为便于统计，将弱阳性和阴性归为阴性，阳性和强阳性归为阳性[2]。
1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0行χ2检验及列联表的关联性分析，检验标准α=0.05。
2 结果
2.1 免疫组化与原位杂交结果 Netrin—1蛋白阳性信号位于正常食管鳞状上皮细胞、食管癌细胞或癌旁不典型增生细胞胞膜，在细胞与细胞的接触面的表达更为清晰，呈棕黄色颗粒，见图1A。Netrin—1 mRNA阳性信号位于正常食管鳞状上皮细胞、食管癌癌细胞或癌旁不典型增生细胞胞质中，呈蓝紫色颗粒，见图1B。
2.2 食管鳞癌组织中Netrin—1、VEGF的蛋白及mRNA表达 见表1。食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织与正常食管黏膜组织中Netrin—1、mRNA表达，差异均有统计学意义(P均<0.05)。
2.3 Netrin—1蛋白表达与食管癌转移的关系 见表2。有淋巴结转移的食管鳞癌组织中Netrin—1蛋白及mRNA表达均高于无淋巴结转移的相应组织(P均<0.05)3 讨论
食管癌是中老年人易患的肿瘤。有文献报道，食管癌的发病率在过去的20～30年中呈现上升趋势[3] 。目前临床上所发现的食管癌组织学类型大多数为鳞状细胞癌，腺癌相对较少。现有资料表明，食管癌的发生可能是多种因素综合作用的结果，其中神经轴突导向因子在食管癌发生、发展过程中起着重要作用。Lu报道：去除Netrin—l基因表达，会导致内皮端细胞伪足迷乱、过度分枝和方向异常，提示Netrin—l具有调控血管方向和形态发生功能[5]。因此，Netrin—1与恶性肿瘤侵袭性的关系也受到重视[4]。Mazelin等基于Netrin—l转基因小鼠的研究证实：Netrin—l在转基因小鼠的结肠中高表达，而其受体DCC和UNC5 h在所有肠上皮细胞中均有表达，与之相应的表型是结肠增生和腺瘤发生频率增高，提示Netrin—1可能作为原癌基因在结肠癌的早期发挥重要作用[5] ......
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