线粒体ND4基因12026A→G变异与2型糖尿病的相关性研究(1)
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【摘要】 目的 研究延边地区T2DM患者线粒体ND4基因变异情况，探讨线粒体基因变异与2型糖尿病的相关性。方法 应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymorphism chain reactionrestriction fragment length polymorphism, PCRRFLP)技术和直接测序法对延边地区人群108例正常健康体检者、328例2型糖尿病患者(其中80例有家族史)，进行线粒体DNA呼吸链复合物NADH脱氢酶第四亚单位(ND4)区域基因突变筛查及分析所有受试者的临床生化指标。 结果 ① 在328例2型糖尿病患者中线粒体DNA 12026 A→G变异20例(其中16例变异个体合并糖尿病肾损伤)，其变异率为61%；在108例对照组中检出线粒体DNA 12026 A→G变异1例，其变异率为09%(χ2=3740，P<005)。②2型糖尿病患者中线粒体基因12026 A→G变异组与非变异组的FBG,HbA1c和Cr比较，差异有统计学意义(P<005)。结论 ①线粒体DNA 12026 A→G变异与延边地区2型糖尿病的发生有一定的相关性，可能加重糖尿病的病情。②线粒体DNA 12026 A→G变异与FBG,HbA1c和Cr有关。
【关键词】 2型糖尿病；线粒体基因；变异
糖尿病是最常见的内分泌代谢性疾病，是一种多基因疾病，遗传因素在糖尿病的发生发展中起着重要的作用，近年来学者们应用分子生物学技术，研究糖尿病的候选基因，探讨其遗传学发病机制。文献报道，在不同种族、不同地区的2型糖尿病患者中线粒体基因的突变率不同，线粒体基因突变与糖尿病关系的观点不一[1，2]。本研究对延边地区328例2型糖尿病患者(其中80例有家族史)及108例正常对照组线粒体DNA ND4基因进行突变分析，旨在探讨延边地区T2DM患者线粒体DNA基因变异情况及线粒体基因变异与2型糖尿病的相关性。
1 资料与方法
11 研究对象 随机选取在延边大学附属医院健康体检者108例：男65例、女43例，平均年龄(304±97岁)作为正常对照组，临床和实验室检查均正常，排除肝、肾、内分泌和心脑血管疾病，近3个月无服用任何药物史；选取2009年12月至2012年2月在延边大学附属医院内分泌科住院的2型糖尿病患者328例：男194例、女134例，平均年龄(351±69)岁。糖尿病诊断依据1999年WHO诊断标准，排除妊娠、急性感染、肿瘤、外伤、心、肝疾病及服用羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、噻唑烷二酮类药物者。根据线粒体DNA基因变异情况将T2DM患者分为基因变异组和基因非变异组。所有受检对象均为延边地区无血缘关系个体，均签署知情同意书。
12 研究方法 ①
基因组DNA提取:采用Promega公司生产的Wizard@ Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被受检者肘静脉血2 ml到加有EDTA抗凝剂的真空采血管中，并立刻颠倒混匀，置于离心机中3000转离心10 min，取300 μl白细胞加入到15 ml离心管中，按照细胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白质、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的过程分别加入试剂，进行DNA的提取。所得DNA经紫外分光光度计定量，并置于70℃保存备用。②PCR扩增mtDNA ND4区域基因片段，根据GenBank中所报告的序列参考文献报道[3]，采用北京华美公司合成的上游引物上游引物：5TTT ACCACAACACAATGGGG3，下游引物5AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT3；PCR扩增体系(50 μl):包括5×Green GO Taq Buffer 10 μl,MgcL2 2 μl，dNTP 1 μl，上游1 μl，下游1 μl，Taq DNA聚合酶,025 μl，灭菌注射用水2975 μl，DNA 5 μl；PCR循环参数：95℃预变性5 min，95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，循环35次，最后72℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。③PCR产物的限制性酶切：20 μl酶切体系包括PCR产物5 μl，HincII内切酶 05 μl，灭菌注射用水145 μl，置于37℃水浴箱中水浴3 h。5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。④PCR扩增产物直接测序：PCR产物用凝胶电泳DNA回收试剂盒纯化回收DNA片段后，送北京奥莱博生物技术有限责任公司，完成PCR扩增产物测序。
13 统计学方法
用SPSS 170软件包进行分析。主要检测指标均进行资料分布类型检验和方差齐性检验，正态分布的各统计指标以均数±标准差(x±s)表示，行t检验，率的比较行χ2检验。
2 结果
21 线粒体DNA ND4(nt1199012199)区域经PCR扩增后得到产物片段长度为209bp(见图1)，限制性内切酶HincⅡ酶切识别位点为GTY↓RAC(R=A或G,Y=G或T)，线粒体DNA 12026位点发生变异时将被分割成171bp和38bp两个片段。(见图2)。直接测序发现线粒体基因12026位点发生A→G变异(见图3)。
22 在328例2型糖尿病患者中共检出线粒体DNA 12026 A→G变异20例，其变异率为61%；在108例对照组中检出线粒体DNA 12026 A→G变异1例，其变异率为09% (χ2=4740，P<005)(见表1)。23 2型糖尿病患者中线粒体基因12026A→G变异组与非变异组在空腹血糖，糖化血红蛋白及肌酐比较有统计学差异，P<005；在病程，体重指数，餐后2 h血糖等临床资料比较无统计学差异，P>005(见表2)。
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