银杏达莫对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
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【摘要】 目的 观察银杏达莫对局灶性脑缺血大鼠大脑缺血坏死区周边抑凋亡基因蛋白Bcl2和促凋亡基因蛋白Bax表达的影响。方法 ①选用健康成年Wistar大鼠20只。体质量270~300 g。② 按随机抽签法将大鼠分为2组：缺血对照组、银杏达莫治疗组，每组10只。③术后6 h用免疫组化染色统计Bcl2和Bax表达阳性细胞数。结果 银杏达莫治疗组较缺血对照组缺血坏死区周边脑组织Bcl2的含量有明显增加，而Bax的含量则明显减少。结论 银杏达莫可对局灶缺血性脑损伤起到预防性保护作用，其保护作用发生可能与提高Bcl2表达、抑制Bax表达有关。
【关键词】 银杏达莫；凋亡；Bcl2；Bax
缺血性脑血管疾病在临床上发病率、致残率高，是我国临床患者主要的病死原因之一。凋亡是脑缺血后神经元死亡的重要方式，目前认为细胞凋亡受Bcl2、Bax等多种凋亡相关基因的调控。而银杏达莫能减轻神经细胞凋亡，但机制尚不完全清楚。本实验研究银杏达莫对大鼠局灶性脑缺血后神经细胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白表达的影响。现报告如下。
1 资料与方法
11 一般资料 材料选用鼠龄3个月左右，体重270～300 g的健康雄性Wistar大鼠20只(由山东大学医学院动物实验中心提供)，随机分为缺血对照组、缺血6 h组，每组10只动物。缺血后6 h组于术后20 min经腹腔注射银杏达莫(山西普德药业股份有限公司)04 ml/kg；对照组腹腔注射生理盐水，注射总量皆为04 ml/kg。皆于术后6 h断头取脑。
12 方法
121 动物模型制备大鼠大脑中动脉缺血模型参考改良Nagasawa法。
122 切片的制备实验动物在缺血6 h后以多聚甲醛经心脏灌注固定，断头取脑，再以多聚甲醛固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋，视交叉平面冠状切开制成2 mm 厚的组织块。
123 ①常规HE染色病理检查。②Bcl2和bax免疫组化染色Bcl2及Bax试剂盒购于武汉博士德公司，具体操作按说明书进行。
124 OLYMPUS光学显微镜观察切片每只动物测3张切片，分别观测Bcl2、Bax阳染数目。阳性反应物部位呈棕黄色，细胞核呈淡蓝色。不重复选取10个高倍视野，计数每个视野内阳性染色细胞数，取平均值。
13 统计学方法 采用SPSS 100统计软件包进行数据处理。组间比较采用t检验，以P<001为差异有统计学意义。
2 结果
Bcl2、Bax阳性细胞胞浆呈棕黄色，均匀弥漫染色，大鼠大脑中动脉闭塞后银杏达莫治疗组较缺血对照组缺血坏死区周边脑组织Bcl2的含量有明显增加， 而Bax的含量则明显减少。
3 讨论
凋亡是脑缺血后神经元死亡的重要方式，尤其是迟发性神经元死亡[1]。Li Y等[2]提示较长时间的脑缺血，凋亡主要发生在梗死周边区的内缘即所谓的“半暗带”。原癌基因B细胞淋巴瘤2(Bc12)基因家族中Bcl2和Bax基因是反映细胞凋亡但作用相反的一组重要调控基因，Bcl2以细胞器膜(如线粒体、内质网和核膜)的整和膜蛋白形式存在，Bcl2抑制细胞凋亡,具有明显的抗神经细胞凋亡作用，可保护神经细胞；而Bax则以非活性的形式分布于胞浆中或细胞骨架上，Bax促进细胞凋亡[3]。
银杏达莫注射液为银杏叶提取物并在此基础上加入双嘧达莫的复合制剂, 其主要有效成分为:银杏黄酮甙24%、银杏苦内酯31%、白果内酯29%、双密达莫10%，银杏黄酮甙和萜内酯。Unal等[4]发现长期给予银杏达莫可以增加大鼠局灶性脑缺血后Bcl2的基因表达。Jelie[5]等实验表明银杏达莫能上调PC12细胞的Bcl2表达、抑制caspase3激活、下凋caspase12、减少细胞色素C释放和DNA断裂，减少细胞凋亡发生。本研究显示银杏达莫能升高大鼠局灶性脑缺血后Bcl2表达，降低bax表达，Bcl2/Bax比值升高，减少细胞凋亡发生，对脑缺血起保护作用。其可能的机制：①在血液学方面有改善微循环作用，增加红细胞变形能力，拮抗血小板活化因子，抑制血小板活化与聚集，降低血液黏滞度，抗血栓形成。②在能量代谢方面有保护线粒体的功能，减少酸中毒，清除氧自由基，防止自由基对神经细胞的损伤，抑制自由基诱导的神经细胞坏死和凋亡。③通过对抗兴奋性氨基酸的毒性作用，减轻脑水肿，减少脑梗死的面积。④刺激前列环素和内皮舒张因子，抑制细胞内钙超载。
本研究认为, 银杏达莫具有减少细胞凋亡，对脑缺血起保护作用，是治疗急性脑梗死、挽救缺血半暗带有效的药物。
参 考 文 献
[1] Kensuke Murakami， Takeo Kondo， Pak H Chan Reperfusion following focal cerebral isehemia alters distribution of neuronal cells with DNA fragmentation in mice Brain Res,1997，751(1)：160164.
[2] Li Y， Chopp M， Jiang N， et al Induction of DNA fragmentation after 10 to 120 minutes of focal cerebral isehemia in rats Stroke，1995,26(7)：12521258.
[3] Yamamoto C M， Sinha Hikim A P， Huynh P N， et al Redistribution of Bax is an early step in an apoptotic pathway leading to germ cell death in rats， triggered by m ild testicular hyperthermia Biol Reprod，2000，63(6)：16831690.
[4] Unal 1， Gursoyozdemir Y， Bolay H， et al Chronic daily administration of selegiline and EGb761 increases brains resistance to ischemia in mice Brain Res，2001,91 7(2)：174181.
[5] Smith JV， Burdick AJ， Golik P， et al Antiapoptotic properties of Ginkgo biloba extract EGb761 in differentiated PC12 cells Cel1 Mol Biol，2002,48(6)：699707.
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