葡萄籽提取物对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制研究(1)
【摘要】 目的 探究葡萄籽提取物(GSE)对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制作用。方法 将大鼠系细胞膜分为常规组(NG组)、高糖组(HG组)和高糖联合GSE(高、中、低)组， 对蛋白/细胞数量比值、细胞增殖、细胞周期变化和P21与P27表达情况进行分析。结果 将NG组为比较对象， 其他组在系膜通过高糖连续性培养2 d 后， 蛋白/细胞数呈现出上升趋势， HG联合中剂量GSE组和HG联合大剂量组的细胞蛋白/细胞数比值呈现出下降趋势， 差异有统计学意义(P<0.05)。将NG组为比较对象， 其他组经高糖培养48、72 h后， 系膜细胞的增值水平减弱， HG联合中剂量GSE组和HG联合大剂量组明显高于HG组， 差异有统计学意义(P<0.05)。系膜细胞经过D-葡糖连续刺激2 d后， 两种物质的蛋白质水平显著提升， 差异有统计学意义(P<0.05)。经高糖联合GSE处理后， 以单独高糖组为研究对象， 证明GSE可全面对P21和P27起到抑制上升， 浓度存在依赖性， 差异有统计学意义(P<0.05)。系细胞膜经过高糖连续刺激48 h后， 细胞G0/G1期的比例显著上升， 和S期相比显著减少， 差异有统计学意义(P<0.05)。HG联合中量GSE组和HG联合高粱GSE组细胞的G0/G1比例下降， S期细胞明显提升， 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GSE可全面抑制高糖诱导系细胞膜肥大， 证明该物质能够全面缓解DN的疾病进展。
【关键词】 高糖；系膜细胞肥大；葡萄籽提取物
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.17.195
糖尿病肾病(DN)发病机制较为复杂， 值得说明的是， 对1型和2型糖尿病患者的肾脏组织标本实施形态学分析可见， DN细胞在表型转化先期主要特征为细胞异常肥大[1]， 其中又以系膜细胞肥大最为显著， 且在DN病理后期和系细胞膜肥大之间存在关联性。对高糖诱导系细胞膜肥大进行全面干预， 对于先期干预DN疾病进展、延长DN患者的生存时间有着非常重要的现实意义。GSE有着差异化生物活性， 有相关研究证实， 对于糖尿病大鼠使用一定剂量的GSE， 可提升肾脏功能水平。出现这种情况的原因和减少糖尿病小鼠糖基化参数、肾组织生长因子和提升肾脏抗氧化水平密切相关， 且当前鲜有文献对葡萄籽提取物对DN的分子和细胞作用加以阐述。为了全面探究葡萄籽提取物对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制情况， 本文联系实际， 对该命题进行全面研究， 重点在于分析其作用分子机制， 现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 材料 原青花素含量≥95%的 GSE， 大鼠系膜细胞， RIPM1640培养基， 胎牛血清(FBS)， D-葡糖， 兔来源抗P21CIP和P27KIP。
1. 2 方法 在培养液内加入青霉素， 浓度为10%的 FBS溶液， 链霉素溶液， 剂量均为100 U/ml， 将大鼠系膜细胞放置于上述培养液中， 混合完毕后， 将样本放在37℃， 5%体积分数二氧化碳饱和湿度培养箱。在细胞出现单层贴壁生长后， 每2天实施传代1次， 选择对数生长期细胞作为本实验原料。
1. 2. 1 分组原则 选择适当密度对系膜细胞转种， 在进行实验以前， 使用FBS培养液1640进行同步培养， 在16 h后， 加入剂量不相同的GSE在FBS培养液中继续培养48 h。本次实验将所有样本分成高糖组(HG组)， 正常组(NG组)， 高糖联合GSE(高、中、低)组。实验前， 将GSE分成1.5、10 mmol/L溶液， 实验中以1∶1000为比例， 稀释为1.5、10 μmol/L的GSE。
1. 2. 2 细胞增殖能力检测 将对数系膜细胞加以收集， 调配好悬浊液浓度， 细胞种植在孔板内， 贴壁， 经16 h后， FBS同步， 更换新的培养液。将0、24、48、72 h视为观察点， 对增殖情况进行观察， 在此过程中， 吸去清液， 洗涤PBS， 弃置上清液。在每个小孔中加入新的培养液。后加入MTT液， 连续培养3 h， 后吸去孔内培养液。完毕后在孔内加入二甲基亚砜， 在恒温环境下培养15 min， 等到晶体溶解后， 使用监测设备测量吸光值， 计算活细胞数量。
1. 2. 3 蛋白/细胞数计算 各组细胞在刺激48 h后， 胰酶消化细胞， 计算各个小组总细胞数量。离心， 置入Ep管内， 增加裂解液， 0℃环境留置30 min， 离心， 上清液为蛋白量。
1. 2. 4 细胞周期检测 在各组细胞刺激48 h后， 洗涤PBS行双重洗涤， 消化完毕后， 离心收集， 放置在离心管内， 选择一定数量细胞， 使用酒精在4℃环境下固定， 连续12 h。计算前离心， 去掉乙醇， PBS双重洗涤， 将上述物品碘化丙啶， 暗处染色， 时长为7.5 min， 使用细胞仪收集样本， 经专业软件进行相关分析。
1. 2. 5 P21CIP和P27KIP蛋白量检测 选择浓度为0.25%胰酶消化细胞， 离心， PBS双重漂洗， 转入EP管， 混合RIPA裂解液， 以0℃环境冰浴。共计0.5 h， 离心， 上清液为蛋白。
使用二喹甲酸(BCA)法对蛋白浓度进行测定。蛋白电泳， 后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜， 使用丽春红染色处理， BSA/TBST封闭， 温度为4℃ ， 在60 min后， 加入经稀释的P21CIP和P27KIP孵育12 h， 后使用TBST三重漂洗， 稀释， 标记好的羊抗兔孵育1 h， 使用TBST行三重漂洗， 显影， 胶片记录。
1. 3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示， 采用t检验；计数资料以率(%)表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果, 百拇医药(郑欣)
【关键词】 高糖；系膜细胞肥大；葡萄籽提取物
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.17.195
糖尿病肾病(DN)发病机制较为复杂， 值得说明的是， 对1型和2型糖尿病患者的肾脏组织标本实施形态学分析可见， DN细胞在表型转化先期主要特征为细胞异常肥大[1]， 其中又以系膜细胞肥大最为显著， 且在DN病理后期和系细胞膜肥大之间存在关联性。对高糖诱导系细胞膜肥大进行全面干预， 对于先期干预DN疾病进展、延长DN患者的生存时间有着非常重要的现实意义。GSE有着差异化生物活性， 有相关研究证实， 对于糖尿病大鼠使用一定剂量的GSE， 可提升肾脏功能水平。出现这种情况的原因和减少糖尿病小鼠糖基化参数、肾组织生长因子和提升肾脏抗氧化水平密切相关， 且当前鲜有文献对葡萄籽提取物对DN的分子和细胞作用加以阐述。为了全面探究葡萄籽提取物对高糖诱导系膜细胞肥大的抑制情况， 本文联系实际， 对该命题进行全面研究， 重点在于分析其作用分子机制， 现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 材料 原青花素含量≥95%的 GSE， 大鼠系膜细胞， RIPM1640培养基， 胎牛血清(FBS)， D-葡糖， 兔来源抗P21CIP和P27KIP。
1. 2 方法 在培养液内加入青霉素， 浓度为10%的 FBS溶液， 链霉素溶液， 剂量均为100 U/ml， 将大鼠系膜细胞放置于上述培养液中， 混合完毕后， 将样本放在37℃， 5%体积分数二氧化碳饱和湿度培养箱。在细胞出现单层贴壁生长后， 每2天实施传代1次， 选择对数生长期细胞作为本实验原料。
1. 2. 1 分组原则 选择适当密度对系膜细胞转种， 在进行实验以前， 使用FBS培养液1640进行同步培养， 在16 h后， 加入剂量不相同的GSE在FBS培养液中继续培养48 h。本次实验将所有样本分成高糖组(HG组)， 正常组(NG组)， 高糖联合GSE(高、中、低)组。实验前， 将GSE分成1.5、10 mmol/L溶液， 实验中以1∶1000为比例， 稀释为1.5、10 μmol/L的GSE。
1. 2. 2 细胞增殖能力检测 将对数系膜细胞加以收集， 调配好悬浊液浓度， 细胞种植在孔板内， 贴壁， 经16 h后， FBS同步， 更换新的培养液。将0、24、48、72 h视为观察点， 对增殖情况进行观察， 在此过程中， 吸去清液， 洗涤PBS， 弃置上清液。在每个小孔中加入新的培养液。后加入MTT液， 连续培养3 h， 后吸去孔内培养液。完毕后在孔内加入二甲基亚砜， 在恒温环境下培养15 min， 等到晶体溶解后， 使用监测设备测量吸光值， 计算活细胞数量。
1. 2. 3 蛋白/细胞数计算 各组细胞在刺激48 h后， 胰酶消化细胞， 计算各个小组总细胞数量。离心， 置入Ep管内， 增加裂解液， 0℃环境留置30 min， 离心， 上清液为蛋白量。
1. 2. 4 细胞周期检测 在各组细胞刺激48 h后， 洗涤PBS行双重洗涤， 消化完毕后， 离心收集， 放置在离心管内， 选择一定数量细胞， 使用酒精在4℃环境下固定， 连续12 h。计算前离心， 去掉乙醇， PBS双重洗涤， 将上述物品碘化丙啶， 暗处染色， 时长为7.5 min， 使用细胞仪收集样本， 经专业软件进行相关分析。
1. 2. 5 P21CIP和P27KIP蛋白量检测 选择浓度为0.25%胰酶消化细胞， 离心， PBS双重漂洗， 转入EP管， 混合RIPA裂解液， 以0℃环境冰浴。共计0.5 h， 离心， 上清液为蛋白。
使用二喹甲酸(BCA)法对蛋白浓度进行测定。蛋白电泳， 后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜， 使用丽春红染色处理， BSA/TBST封闭， 温度为4℃ ， 在60 min后， 加入经稀释的P21CIP和P27KIP孵育12 h， 后使用TBST三重漂洗， 稀释， 标记好的羊抗兔孵育1 h， 使用TBST行三重漂洗， 显影， 胶片记录。
1. 3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示， 采用t检验；计数资料以率(%)表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果, 百拇医药(郑欣)