辽宁省2016～2017年甲型H3N2亚型流感病毒耐药性分析(1)
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【摘要】 目的 分析辽宁省2016～2017流感年度H3N2亚型流感病毒M2蛋白和神经氨酸酶(NA)基因特点， 了解并掌握该年度省内流感毒株对烷胺类药物及NA抑制剂类药物的耐药情况， 为流感的治疗及防控提供科学依据。方法 选取辽宁省内各市流感样病例， 经病毒分离获得的甲型H3N2亚型流感毒株55株， 对M2基因及NA基因进行扩增并测序后对耐药位点进行分析。结果 2016年4月～2017年3月， 辽宁省共采集流感样病例标本13956份， 分离流感毒株1528株。其中甲型流感毒株835株， H3N2亚型毒株378株， 约占甲型流感毒株的45.3%。测序获得55株H3N2亚型流感毒株的M2基因片段(第572～1027核酸位点和NA基因片段(第1～914位核苷酸位点)核苷酸序列。经比对分析， 全部检出S31N突变， 对烷胺类药物均表现为耐药。此外， 所有毒株的第51位均发生了异亮氨酸到缬氨酸的突变。NA基因耐药位点均未检出突变， 未发现NA抑制剂类药物的耐药株。结论 辽宁省2016～2017年流行的甲型H3N2亚型流感病毒普遍对烷胺类药物耐药， 未发现NA抑制剂类药物的耐药株。因此， 奥司他韦等NA抑制剂类药物是治疗H3N2型流感的敏感药物。但在实际工作中仍应对耐药性进行监测， 实时关注耐药株的产生。
【关键词】 甲型H3N2亚型流感；耐药性分析；烷胺类药物；神经氨酸酶抑制剂
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.09.117
流感病毒是引起流行性感冒的病原体， 常在北方冬春季引起暴发或流行。全球监测数据显示， 在季节性流感病毒中， 甲型H3N2亚型流感病毒能够引起人群更为严重的呼吸道症状[1， 2]。2016～2017年辽宁省流感流行呈现甲型H1N1和H3N2亚型共流行的情况。甲型H3N2流感病毒与新甲型H1N1流感病毒所导致的疾病负担相似[3]， 因而应时刻关注H3N2亚型流感病毒的流行情况及耐药情况。目前， 流感疫苗是用于流感预防的最佳手段。但由于人群接种率低， 抗病毒药物依然是治疗和预防流感的主要措施。现阶段国内常用的抗流感病毒药物主要有M2蛋白抑制剂和NA抑制剂两大类。经过多年耐药监测发现， 流感病毒对烷胺类药物耐药比例不断升高， 至今几乎全部耐药；NA抑制剂类药物的耐药株也呈增加趋势， 因此， 流感毒株耐药监测工作对流感的治疗及预防具有十分重要的意义。本研究对2016～2017年辽宁省甲型H3N2亚型流感病毒的耐药情况进行分析， 为流感防治工作奠定基础。现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 标本来源 采集2016年4月～2017年3月辽宁省各国家级监测哨点医院流感样病例标本。
1. 2 病毒分离 采用狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离。细胞病变后使用红细胞凝集方法进行试验， 滴度>1∶8的毒株用红细胞凝集抑制试验进行分型(试剂由国家流感中心提供)。研究所用毒株均经过国家流感中心复核鉴定。
1. 3 毒株选择 选取55株不同地区国家级哨点医院采集的流感样病例标本分离得到的甲型H3N2亚型流感毒株。
1. 4 核酸提取 使用EZ1 Virus Mini Kit V2.0(cat.No.955134)试剂盒进行核酸提取， 提取量60 μl。核酸提取后立即使用或置于-70℃冻存。
1. 5 聚合酶链式反应(PCR)检测 M2基因引物序列[4]为MF：5‘-CAGGTAGATATTGAAAGAT-3’；MR：5’-GTAGAAACAAGGTAGTTTT-3’；NA基因引物序列[5]为NaF：5‘-GCAAAAGCAGGAGTGAAAR-3’；NaR：5-ATATCTACTATGGGCCTATTGGA-3’。以上引物均由invitrogen公司合成。
1. 6 逆转录(RT)-PCR反应 扩增毒株的M2基因和NA基因。采用Qiagen one-step PCR kit进行扩增。反应条件：50℃反转录30 min；95℃灭活反转录酶15 min；94℃ 30 s， 55℃ 60 s， 72℃ 60 s共40个循环；72℃ 10 min延伸；4℃保持。反应设置阴阳性对照。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1. 7 核酸测序 PCR扩增产物送invitrogen公司进行核苷酸双向测序。
1. 8 序列分析 采用Bioedit、DNAstar和Mega6.0分析软件对M2基因和NA基因序列分析和氨基酸序列的同源性分析。通过耐药的分子标記鉴定耐药株。据报道， 与M2基因耐药有关的分子标记有L26F、V27A、A30T、S31N和G34E[6]。与NA基因耐药有关的分子标记有E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K和N294S[7]。只要上述位点中有任意位点发生突变， 病毒即产生耐药性。
2 结果
2. 1 病毒流行情况 2016年4月～2017年3月辽宁省共采集流感样病例标本13956份， 分离流感毒株1528株。其中甲型流感毒株835株， H3N2亚型毒株378株， 约占甲型流感毒株的45.3%。
2. 2 耐药位点分析 测序获得55株H3N2亚型流感毒株的M2基因片段(第572～1027核酸位点和NA基因片段(第1～914位核苷酸位点)核苷酸序列。经比对分析， 全部检出S31N突变， 对烷胺类药物均表现为耐药。此外， 所有毒株的第51位均发生了异亮氨酸到缬氨酸的突变。NA基因耐药位点均未检出突变， 未发现NA抑制剂类药物的耐药株。耐药位点检出情况。见表1。, 百拇医药(孙海波 刘双 宋亦春 王璐璐 孙佰红 毛玲玲 孙英伟)