脑红蛋白在糖尿病大鼠视网膜病变发展中的表达变化(2)
1. 2. 3 原位杂交 二甲苯脱蜡, 乙醇水化, 依次经100%、95%、80%、75%乙醇和焦碳酸二乙酯(DEPC-H2O)各1次, 5 min/次, 0.2 mol/L 盐酸溶液(HCL)室温处理5 min, PBS洗片3次, 蛋白酶K(40 μg/ml)室温下孵育20 min后, 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次, 5 min/次, 4%多聚甲醛固定10 min后, PBS洗片2次, 醋酸干和三乙酸溶液室温下孵育10 min, PBS洗片2次, 50℃滴加预杂交液进行预杂交2 h, 50℃过夜杂交, 柠檬酸钠缓冲液(SSC)洗涤后, 洗膜缓冲液(TBST)洗5次后, 室温下封闭1 h, 滴加抗地高辛一抗(1∶1000)4℃孵育过夜。TBST洗4次, 碱性磷酸酯酶显色缓冲液(BCIP/NBT)染色液缓冲液洗2次, BCIP/NBT暗处染色24 h, TE缓冲液(pH 8.0)洗2次终止反应, 核固红复染5 min, 水洗残夜, 梯度酒精脱水, 透明封片。镜检, 拍照。1. 2. 4 Western blotting RIPA裂解液裂解组织提取视网膜织总蛋组白 ......
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