实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义(2)
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【Key words】
Hepatitis B Serum Markers;Timeresolved Fluorescence Immunoassay;Fluorescence Quantitative PCR Technique;Clinical Application
DOI:10.3760/cma.j.issn 16738799.2010.01.48
作者单位:628000广元市中心医院
本文用荧光定量PCR法研究乙型肝炎患者HBVDNA定量检测与血清学免疫标志物水平之间的关系。并就其测定的临床价值报告如下。
1 资料与方法
1.1 血清标本来源 850份血清标本均取自2009年1月至2009年6月本院门诊及住院的患者。其中,男385例,女465例,平均年龄37.2岁。
1.2 血清标本的采集 采用一次性真空采血管,清晨空腹抽取静脉血5 ml,离心分离血清,20 ℃冻存备用,集中检测。
1.3 试剂 乙肝血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb定量采用上海新波公司生产的时间分辨乙肝两对半试剂盒。荧光定量HBVDNA采用深圳达安公司HBVDNA扩增试剂盒。
1.4 仪器 乙肝定量使用ANYTEST 2000时间分辨仪及配套洗板机和混匀仪,荧光定量PCR用罗氏LightCycle实时荧光定量检测系统检测。
1.5 方法 乙肝标志物检测采用时间分辨法,HBVDNA采用实时荧光定量PCR法。
1.6 统计学方法 配对卡方检验。
2 讨论
血中HBVDNA的存在是HBV感染最为直接,最为灵敏和最为特异的指标。实时荧光定量PCR是目前临床检测血清HBVDNA常用的分子生物学方法。检测重复性好,而且实时荧光定量PCR还解决了抗病毒药物疗效观察的一大难题。850例标本,大三阳302例标本中有261份HBVDNA为阳性,阳性率为86.4%,其PCR定量拷贝数为(2.21±0.76)×107/ml;小三阳321例中有96份HBVDNA阳性,阳性率达到29.91%,PCR定量拷贝数为(1.69±0.98)×106/ml;32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有9份HBVDNA为阳性,阳性率为28.13%,28份HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有4份PCR HBVDNA阳性,阳性率14.29%;11份HBcAb(+)标本有6份PCR HBVDNA阳性,阳性率为42.9%;74份HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有5份HBVDNA阳性,阳性率45.45%;13份HBsAb(+)、HBeAb(+)阳性标本有2份PCR HBVDNA阳性,阳性率为14.3%;12份HBsAb(+)、HBcAb(+)标本有1份HBVDNA阳性,阳性率7.69%;4份HBsAb(+)的标本HBVDNA均为阴性,PCR定量拷贝数为<1.00E×103;24份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有21份HBVDNA为阳性,阳性率为87.50%;1份HBsAg(+)标本HBVDNA均为阳性,阳性率为100%;10份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有3份HBVDNA均为阳性,阳性率30.00%,其余38例全阴性结果和各少见模式基本见有HBVDNA的检出。文献报道有些出入[1];168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有118份HBVDNA阳性,阳性率为70.2%,PCR定量拷贝数为(4.65±2.10)×105/ml。血清HBVDNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒复制状态,具有很多临床价值,但检测费用较高[2,3],而且不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态,HBVDNA检测低于检测线下限并不代表体内HBVDNA已被完全清除,结合其他血清学免疫指标和生化学指标更能客观反映体内HBV病毒状态,正确判断预后和治疗。在实践中,常遇到的问题是乙肝标志物测定结果与HBVDNA检测结果之间的不一致,有两种情况:一是HBsAg阴性而HBVDNA PCR测定阳性;二是HBsAg阳性但HBVDNA阴性。前者可能是因为HBsAg标志物测定敏感性低,对极低浓度的HBsAg测不出,而PCR具有极高的灵敏度,HBVDNA含量即使很低(甚至低至数个分子),亦可检测出来;或HBsAg确已消失,但HBVDNA仍持续存在,病毒仍处于低水平复制状态;此外,在HBV初期感染时,也可能是有HBVDNA而无HBsAg。HBVDNA阴性才是HBV消除的明确指标。HBsAg阳性而HBVDNA阴性其原因一为血中HBVDNA虽然存在,但是在特定的PCR检测方法的下限以下,如有的PCR试剂灵敏度差,检测HBVDNA的下限仅至1 000个拷贝。第二种可能为血中存在的HBsAg是由HBVDNA整合到人染色体与宿主基因共同表达所致,所以测不到血清中病毒DNA。通常,HBsAg阳性血清,PCR检测HBVDNA的阳性率约为96%。HBV感染后至恢复期抗HBs阳性,血清HBVDNA PCR检测一般为阴性,少部分亦可为阳性。HBeAg阳性血清,HBVDNAPCR检测几乎全为阳性,并且大部分(超过60%)含量大于107拷贝/m1;HBeAg阴性而抗HBe阳性者,绝大部分HBVDNA含量小于103拷贝/ml,但仍有少部分(约10%)大于107拷贝/ml;在HBsAg阳性和抗HBc阳性者中,有将近一半其血清HBVDNA含量大于103拷贝/ml,约1/3大于107拷贝/m1 ......
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