P53基因家族的表达与结\直肠癌发生及预后关系的研究(2)
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2.2结直肠组织的细胞消化:DNA提取 A. 加入100ulDP液和10ulProteinase K,迅速振荡混匀,置于55℃温浴至组织完全消化(一般为过夜消化)后,加入200ulDL液,振荡混匀,放置55℃温浴5 min;B. 加入100ul异丙醇,剧烈颠倒离心管混匀后,全部移至吸附柱中,离心30 s(12000转/min),弃去收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管;C. 加入500ulW1液静置1 min后,离心30 s,弃去收集管液体,再用500ulW1液洗脱一次,将吸附柱移入另一干净收集管中;D.在吸附柱中央加入50ulT1液,55℃/65℃静置5 min后,离心1 min。将收集管中液体(DNA) 20℃保存备用。
2.3样品DNA检测 1%琼脂糖凝胶电泳,拖尾严重的DNA弃去不用。
2.4PCR扩增(Polymerase Chain Rraction Amplification) 各个基因外显子,扩增体系均为25 μl;dNTP(2.5 mM)0.25 μl,MgCL2(25 mM)1.5 μl,10×buffer(Mg2+Free)2.5 μl,Taq酶0.3 μl(1 u/μl),两种引物P1、P2各1 μl(12.5 μmol/L),DNA模板2 μl(50~100 ng),ddH2O16.45 μl。矿物油20 μl覆盖。反应在DNA扩增仪上进行。扩增条件:95℃,4 min;循环条件:95℃30 s,64.8℃30 s,72℃50 s,循环30次;72℃延伸10 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳,结束后拍照。P53、P63、P73基因的外显子退火温度各不相同,P53的退火温度为61℃,P63为62.8℃,P73为64.8℃。
2.5 统计学方法 数据用卡方检验进行组间及组内显著性检验,取P<0.05有显著性差异
3 实验结果
3.1 PCR扩增产物分析 58例结直肠癌、50例结肠息肉P53基因家族表达示意图见图1、图2、图3。
图1 P53基因外显子7扩增片段
图2 P63基因外显子6扩增片段
图3 P73基因外显子2扩增片段
从图1、2、3可以看出P53基因1和5这两个标本出现表达缺失,P73基因的4号标本出现表达缺失。所有标本表达情况见表2。
表2
P53基因家族表达情况
例数表达(结直肠癌)不表达例数表达(结直肠息肉)不表达
P53基因4711428
P63基因562482
P73基因562473
表3
P53基因家族表达缺失与结直肠癌
患者5年生存关系
5年后存活5年内死亡χ2值P值
P53基因家族表达3013
P53基因家族不表达694.19<0.05
表4
P53基因家族表达缺失与结直肠息肉
恶变倾向关系
良性腺瘤癌变或不典型增生χ2值P值
P53基因家族表达316
P53基因家族不表达587.68<0.01
3 讨论
自分子生物学技术问世以来,在肿瘤的发生机制、发展过程调控的研究上已取得了飞跃的发展。目前的研究表明:肿瘤的发生、发展是细胞中多种基因突变累积的结果。就结、直肠癌而言,P53基因出现缺失或突变等因素参与下,结直肠息肉容易向癌变方向进展。1997年后,Kaghad等首先发现了P53基因的第一个类似基因 P73基因,随后Schmale等以及其他几个研究小组各自独立发现了P53基因家族的第二个基因 P63基因[2]。它们是否具有和P53基因相同的功能或者和P53基因具有协同功效,目前国内外少见报道。我们的研究发现,58例结直肠癌患者中,有的患者有P53基因的缺失,有的患者有P63或P73基因的表达缺失(P53基因家族表达缺失),但是无一例患者同时出现两个或者两个以上基因的表达缺失,其中原因需要进一步研究。从结直肠癌患者的5年生存率分析,P53基因家族表达缺失的结直肠癌患者的5年生存率要低于P53基因有表达的患者(P<0.05),见表3。另外,我们的研究还发现,在50例肠镜下摘除的息肉中,14例有恶变倾向,其中8例发生在P53基因家族不表达的患者中,经过统计学处理,得出了P53基因表达缺失患者息肉恶变的机会要比有P53基因表达的患者高(P<0.05),见表4。由于样本量较少,并且P63和P73基因在样本中表达缺失的频率不如P53基因,我们还无法得出单独P63基因或者P73基因和息肉恶变、结直肠癌患者5年生存率之间的关系。因此,只能将它们当成一个基因家族研究,这有待于我们以后的工作,增加样本量来进一步阐明单个基因的功能 ......
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