自身肺癌抗原致敏DCs的抗肺癌体外免疫效应研究(2)
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参见附件(2003KB，3页)。
1.2.3 肺癌自身抗原致敏DCs DCs培养第3天换液时加入肺癌自身抗原100μl/孔,第6天每孔加入LPS(5 mg/L),第7天收获成熟DCs。取肺癌自身抗原致敏的成熟DCs(DC瘤苗)与T淋巴细胞和TIL以1∶20比例混合,共培养3 d。DCs递呈抗原并激活幼稚T淋巴细胞,促使T淋巴细胞活化为细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)和肿瘤浸润性淋巴细胞(CTIL)。
1.2.4 MTT法检测DCs瘤苗体外联合抗肺腺癌细胞效应
1.2.4.1 肺腺癌细胞的培养 将人肺腺癌A549细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml的RPM11640培养液中,37℃,5%CO2培养箱培养,每3~4 d传代一次。
1.2.4.2. DCs诱导肺癌特异性CTL 致敏的T细胞(CTL和CTIL)为效应细胞,按效靶比分组,A组:靶细胞对照组(A549细胞);B组:效应对照组(未致敏的T淋巴细胞+ A549细胞);C组:效应对照组(未致敏的TIL细胞+ A549细胞);D1组:肺癌特异性CTL+ A549细胞(效:靶=30:1);D2组;肺癌特异性CTL+ A549细胞(效:靶=20:1);E1组:肺癌特异性CTIL+ A549细胞(效:靶=30:1);E2组:肺癌特异性CTIL+ A549细胞(效:靶=20:1)。将以上细胞接种于96孔板,每组复种8孔,并且重复3次。培养72 h,最后4 h加入MTT20μl(5 mg/ml)。培养4 h后1000 rpm离心5 min弃上清,补入150 μl二甲基亚枫(DMSO),1充分震荡0 min后用酶联免疫检测仪在波长570 nm检测OD值。以下公式计算杀伤活性:CTL杀伤活性=[(效应对照组OD值一实验组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100%。并比较实验组间对肺癌细胞的杀伤效果。
1.2.5 统计学方法 本实验统学计分析均采用SPSS 11.0统计软件。所有数据用表示,采用单因素方差分析,以a=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 DCs的体外培养 外周血分离获得单个核细胞(MNCs),贴壁2 h后吸出悬浮淋巴细胞,获得贴壁良好的小而圆的单核细胞(Mo),加入GM CSF和IL 4,细胞培养24 h后均可见贴壁的Mo聚集成均匀散布的细胞聚体(粒 巨噬细胞集落形成单位,GM CPU)。3 d后可见部分细胞有突起伸出,5 d后大量突起交织在一起。培养7 d后,大量树突状形态细胞从贴壁、半悬浮状态变为悬浮状态,细胞变大变圆,均匀散布于培养基中,为典型DCs形态(图1)。
图1 倒置显微镜下原代培养的DCs ×200
A培养第3天 B培养第5天
2.2 DCs瘤苗体外联合抗肺腺癌细胞效应与对照组相比,采用效靶比为30:1和20:1的比例,结果肿瘤浸润淋巴细胞TIL比外周血T淋巴细胞杀伤活性强(P<0.05)表1。
表1
DCs瘤苗联合诱导对EC9706的杀伤率(x±s)
分组效应细胞靶细胞效靶比杀伤率(%)
AA549细胞10.52±3.12
B未致敏的T淋巴细胞A549细胞10.98±2.79
C未致敏的TIL细胞A549细胞9.87±4.12
D1CTLA549细胞30:118.21±2.89
D2CTLA549细胞20:124.69±3.51
E1CTILA549细胞30:125.46±3.02
E2CTILA549细胞20:127.52±2.68
注:组间对比P<0.05
3 讨论
肺癌的发病率高,死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肿瘤的主动免疫治疗一直是肿瘤治疗研究的热点,肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是继LAK细胞之后发现的一种新的免疫活性细胞,TIL细胞的研究开辟了治疗晚期恶性肿瘤的领域。树突状细胞(DC)是摄取、加工、呈递抗原的重要专职抗原呈递细胞,它呈递抗原的能力最强,对如何在体内外通过刺激扩增和激活,提高其抗原递呈功能,以诱导特异性的细胞免疫反应等一系列以DC为手段的抗肿瘤免疫成为近年来的一大研究热点,树突状细胞可以向包括肿瘤浸润淋巴细胞在内的T淋巴细胞提呈抗原,并诱发细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。本实验以原代培养的肺癌细胞做抗原,用DC提呈给T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞TIL,来观察其体外对肺癌A549细胞的杀伤效应。
DCs作为功能最强的抗原递呈细胞,能够刺激初始型T细胞的增殖和活化,启动早期免疫应答,并且DCs高表达MHCⅠ类和MHCⅡ类分子,多种共刺激分子及黏附分子,能够激发宿主特异的抗肿瘤免疫,提高效应细胞的毒活性,目前利用DCs独特的免疫学特性制备抗肿瘤疫苗显示了良好的临床应用前景[6]。
笔者分离出原代肺癌细胞和TIL细胞,肺癌细胞贴壁生长,淋巴层收集至另一培养瓶,加上IL 2,可分裂增殖,作为效应细胞,经外周血培养分离出的单核细胞经rhGM CSF,rhIl 4分化诱导成DCs,为贴壁细胞为T淋巴细胞,作为另一种效应细胞,进行对比研究,结果,TIL细胞的杀伤效果比T淋巴细胞的杀伤活性强P<0.05。
DCs影响TIL细胞的生物学特性的机制还不十分清楚。研究发现,DCs和TIL细胞共培养后,发现不仅TIL细胞的增殖活性增加,而且对癌细胞的细胞毒性也明显增加[4,5],笔者的研究也显示了相似的结果,经DCs和TIL细胞共培养后,TIL细胞的增殖活性增加,体外实验显示不同的效靶比TIL的细胞毒活性强于外周血T淋巴细胞。
本实验证实了TIL细胞是比外周血T淋巴细胞增殖更快,杀伤活性更强的免疫效应细胞,具有更广阔的应用前景 ......
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