低温\地塞米松对大鼠睾丸扭转复位后生殖细胞凋亡和抗氧化酶活性的影响(2)
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1.3 睾丸组织学检查 石蜡切片,苏木精 伊红(HE)染色,光镜下观察,每个睾丸组织观察10个低倍镜视野。
1.4 生殖细胞凋亡的检测 Fas、FasL免疫组化染色法,试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,以PBS代替一抗作为阴性对照,已知的阳性组织作为阳性对照,凋亡细胞膜及胞浆染成棕褐色。凋亡指数(apoptosis index,AI):每张切片选取五个高倍镜视野(×400),计数500个细胞,按阳性细胞/(阴性细胞+阳性细胞)公式计算凋亡指数。凋亡指数以阳性细胞百分率表示。
1.5 生化指标的检测 (SOD、CAT活性,MDA含量及组织蛋白吸光度)按照试剂盒要求制备睾丸组织匀浆,化学比色法测定睾丸组织中SOD、CAT活性,MDA 含量(试剂盒购于南京建成生物工程研究所)。
1.6 统计学方法 本实验设计方法采用析因设计,统计分析采用方差分析。计量资料均用表示,各手术组与对照组两两比较用SNK q法,空白对照组与扭转组两样本均数比较用t检验。统计软件采用SPSS11.5及SAS8.0进行分析。
2 结果
2.1 组织学观察 E组大鼠曲细精管生长良好,生精细胞排列整齐,有明显的管腔,细胞形态未见异常。其余各实验组生精细胞排列不整齐,层次减少,上皮部分变性,精细胞数量减少,减少的细胞主要为精原细胞及初级精母细胞,可见凋亡小体及坏死区,并且部分区域可见炎症细胞浸润(以中性粒细胞为主),以A组最为明显,D组最轻。
2.2 生殖细胞凋亡 低温因素与地塞米松因素间有交互效应(P<0.05);
2.3 SOD、CAT活性MDA含量 D组与低温组、地塞米松组间均数比较均有差异,SOD、CAT活性升高,而MDA含量下降,差异有统计学意义(P<0.001)。
低温因素与地塞米松因素间有交互效应(P<0.05);D组与B组、C组间均数比较均有差异,SOD、CAT活性升高,而MDA含量下降,差异有统计学意义(P<0.001);B组、C组与D组间均数两两比较均有统计学意义(P<0.001)。
3 讨论
睾丸扭转是泌尿外科的急症之一,12~18岁是发病的高峰期,约占65%,左侧睾丸扭转较右侧多见,需急症手术处理。睾丸扭转4~6 h未被复位,生精细胞将发生不可逆的死亡[4]。睾丸扭转复位后细胞凋亡情况临床及实验中发现即使短时间、轻度的扭转缺血也会使睾丸以后的生精功能受损[5]。再灌注损伤是睾丸复位后损伤的重要原因。现在,越来越多的研究表明I/R损伤与细胞凋亡密切相关[6]。在缺血 再灌注损伤机制的各种学说中,都与自由基的作用有关。
MDA作为脂质过化代谢终产物,其含量的增高常被用来评价细胞或组织受自由基损伤的严重程度,SOD是体内自由基的主要清除酶,其活性升高表明机体自由基清除加快;超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶类可清除自由基、防止氧自由基对组织的损伤。本实验研究发现,睾丸扭转复位后36 h,A组SOD、CAT活性较低,MDA含量较高,细胞凋亡增加,精细胞数量减少。B、C、D SOD、CAT活性均较A组高,MDA含量较低,表明扭转组睾丸组织清除氧自由基能力下降。
低温保护预防缺血 再灌注损伤主要应用于器官移植,低温能够减缓细胞代谢,保存细胞能量,降低对氧的依赖。Peron[7]等证实低温对大鼠睾丸扭转后的精原细胞有明显保护作用。Smith[8]等人发现严重缺血造成精原细胞损害被救治的关键时间是在发病4 h以内。低温下细胞氧耗量降低,组织内ATP消耗减少,从而由黄嘌呤氧化所产生的氧自由基减少,使由质脂过氧化反应对缺血组织的细胞膜和细胞器的损害程度得以降低[9]。中性粒细胞作为再灌注时自由基、细胞粘附分子的重要来源,在再灌注损伤的发生发展中也起重要作用。地塞米松是人工合成的长效糖皮质激素,可抑制中性粒细胞的粘附,减低毛细血管的通透性,使I/R区渗出、浸润的白细胞数量减少;并可稳定溶酶体膜,减轻脂质过氧化反应,进而减轻睾丸扭转复位引起的I/R损伤[3]。目前对细胞凋亡研究较多的信号转导系统之一为Fas蛋白/FasL信号系统。Fas是细胞膜上的跨膜蛋白, Fas蛋白可以和T细胞表面的FasL结合,也可以和抗Fas的抗体结合,从而启动细胞凋亡,Fas和FasL在细胞凋亡中占有重要地位。本研究发现,扭转组与低温组间比较SOD、CAT活性较低,MDA含量较高,差异明显,有统计学意义(P<0.001);扭转组与地塞米松组间比较SOD、CAT活性较低,MDA含量较高,差异明显,有统计学意义(P<0.001);低温因素与地塞米松因素间有交互效应(P<0.05);左侧睾丸SOD、CAT活性及MDA含量均数两两比较SNK q检验结果:D组与低温组、地塞米松组间均数比较均有差异,SOD、CAT活性升高,而MDA含量下降,差异有统计学意义(P<0.001);低温与地塞米松因素共同作用于扭转侧复位睾丸能明显减轻缺血 再灌注的损害程度。低温、地塞米松因素共同作用较单独作用时效果更明显。
总之,睾丸扭转复位后可导致缺血 再灌注损伤,在复位前对扭转睾丸运用低温保护技术,可提高扭转睾丸耐缺血能力,在一定程度上减轻睾丸组织缺血 再灌注损伤,提高睾丸的生存力。同时,地塞米松也能减轻睾丸组织的缺血 再灌注损伤。二者的作用为协同作用,可以更好的改善抗氧化酶抗氧化功能减轻自由基对组织损伤作用,提高对自由基的清除作用,减轻生精细胞的凋亡,提高复位睾丸的生精功能,因此,可以考虑在睾丸扭转患者得到确诊至手术前用冰袋将其覆盖,尽可能减少睾丸的损害,复位时应用激素药物,对挽救睾丸扭转患者的生育功能有重要临床意义。
参考文献
[1] Lysiak JJ,Nguyen QA,Turner TT.Peptide and nonpeptide renctive oxygen scavengers provide partial rescue of the testis after torsion.J Androl,2002,23(3):400 409.
[2] Turner TT,Tung SK,Tomomasa H,et al.Acute testicular ischemia results in germ cell specific apoptosis in the rat ......
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