丙型肝炎病毒NS3蛋白对QSG7701细胞survivin的影响(2)
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参见附件(1875KB，3页)。
1.3.6 统计学方法 采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HCV NS3蛋白在QSG7701细胞中的表达 Western印迹检测结果显示3株QSG7701 /NS3细胞中均检测到HCV NS3蛋白的特异性条带,而QSG7701 /pcDNA3.1细胞和未转染的QSG7701 细胞中均未见HCV NS3蛋白的表达,证实QSG7701 /NS3细胞稳定表达HCV NS3蛋白。
2.2 HCV NS3蛋白对QSG7701细胞survivin蛋白表达的影响 Western印迹检测结果显示survivin蛋白在5组细胞都表达,在3株转染组细胞中表达较强,未转染组和空白转染组表达较弱,平均为转染组的84.50%,79.47%。表明HCV NS3蛋白促进survivin的表达。
2.3 细胞凋亡对QSG7701/NS3细胞survivin蛋白表达的影响 分别经0%,1%,2%血清饥饿72h,Western印迹在各组细胞中均检测到survivin蛋白的特异性条带(图1),5组细胞经不同浓度血清处理后都表现出相同的趋势,即未转染组与空白转染组survivin蛋白的表达较3株转染组细胞的表达弱,表明血清饥饿诱导细胞凋亡后HCV NS3蛋白亦促进survivin的表达。
任取一株转染组细胞,在细胞对数生长期时分别用0%,1%,2%血清饥饿48 h,72 h ,96 h。可见survivin蛋白表达受抑制,且呈现时间依赖性和剂量依赖性。血清饥饿时间越长,survivin表达逐渐降低,血清浓度越低,survivin表达降低越明显。
图1 Western印迹检测显示1%血清作用72 h各组细胞survivin的表达
1-5泳道分别为QSG7701,QSG7701/pcDNA3.1,QSG7701/NS3-1,2,3
2.4 Survivin在细胞内的表达和定位 免疫细胞化学结果显示survivin表达于细胞质,核内未见阳性表达,转染组表达较强,呈强阳性表达。根据染色强度未转染组,空白转染组与三株转染组可记为2+,2+,3+,3+,3+。经0%血清饥饿72h后,survivin蛋白表达降低,部分细胞呈弱阳性表达。根据染色强度依次可记为1+,1+,2+,2+,2+。
2.5 原位末端标记法检测细胞凋亡 为明确HCV NS3蛋白与QG7701细胞凋亡有关联,笔者用TUNEL法检测各组的凋亡细胞,结果发现各组的凋亡细胞很少,5组凋亡细胞指数无显著性差异(P>0.05)。0%血清处理72h,QSG7701,QSG7701/pcDNA3.1,QSG7701/NS3-1,2,3组平均凋亡指数分别为41.51%,45.31%,31.60%,24.30%,27.58%(图2)。未转染组,空白转染组分别与三株转染组有显著性差异(P<0.05),而未转染组和空白转染组之间及三株转染组之间比较差异无显著性(P>0.05)。
图1 原位末端标记法检测0%血清饥饿72 h QSG7701/NS3细胞的凋亡×400
3 讨论
Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员。正常情况下,survivin仅表达于胚胎组织和发育中的胎儿组织,在终末分化的成人组织中表达缺失,但在多种恶性肿瘤组织中可检测到不同程度和频度的survivin阳性表达。Survivin的表达可促进细胞表型的恶性转化,使细胞逃避生长监控,抑制细胞凋亡,成为某些恶性肿瘤发生的关键因素[4-6]。
Survivin是一个进化过程中高度保守的蛋白分子,可对多种刺激诱导产生的凋亡起抑制作用。HCV NS3与HCV相关性肝癌密切相关,已研究证实HCV NS3表达显著增加NIH3T3细胞端粒酶活性,导致宿主细胞恶性转化[3]。将HCV NS3 区基因转染到NIH3T3和QSG7701细胞中,细胞表型改变,倍增时间明显缩短,且接种裸鼠后成瘤[1,2]。结果表明QSG7701/NS3细胞中survivin蛋白表达上调,用原位末端标记法检测发现细胞的凋亡指数也很低,这表明HCV NS3蛋白在QSG7701细胞中的表达促进survivin基因的上调、抑制细胞凋亡,HCV NS3蛋白可能通过对survivin的调节参与对细胞凋亡的调控。经血清饥饿诱导细胞凋亡,QSG7701/NS3细胞凋亡指数明显上升,同时凋亡细胞survivin蛋白的表达亦下降。这种变化趋势符合survivin的表达与细胞凋亡之间呈负相关的现象。同时进一步证实survivin在HCV相关性肝癌细胞的凋亡调控方面可能发挥着重要作用,部分解释HCV NS3蛋白参与HCV相关性肝癌的发生。
Survivin含有长度为70个氨基酸左右的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR),survivin可通过该结构域与活性caspase3、caspase7结合,抑制其活性,从而抑制多种刺激因子诱导的凋亡[7]。对QSG7701/NS3细胞进行不同浓度、不同时间处理,survivin的表达呈现时间依赖性和剂量依赖性。饥饿时间越长,survivin表达降低越明显;血清浓度越低,survivin表达降低越明显。这与检测到的活性caspase3的表达趋势正好相反[8],即survivin表达水平降低越明显,caspase3酶活性升高越显著。这提示血清饥饿降低QSG7701/NS3细胞中凋亡抑制蛋白survivin的表达,减少survivin与caspase3的结合,使后者的DEVD切割酶活性充分释放出来,引起PARP裂解,最终导致凋亡。
Survivin作用于凋亡途径的汇集点,同时又仅在肿瘤组织中特异的存在,使其成为抗癌治疗最理想的靶点之一。HCV NS3蛋白促进凋亡抑制蛋白survivin的表达,抑制细胞凋亡;在血清饥饿处理后,survivin的高表达受抑制,细胞最终凋亡。这提示可采用基因技术(如survivin反义寡核苷酸转染)封闭survivin蛋白的表达,解除HCV NS3蛋白对survivin的上调作用,诱导HCV相关性肝癌细胞凋亡,达到治疗目的。
参考文献
[1] 何琼琼,程瑞雪,孙意,等.HCV NS3 N端多肽诱导人肝细胞系转化及成瘤实验 ......
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