自动化微板法RHD血型试验液体量选择
【摘要】 目的 探讨自动化微板法RHD血型的试验条件。方法 使用全自动STAR加样机结合微板离心技术,对RHD血型[1]试验条件中液体量进行选择。结果 RHD抗血清,2%红细胞取样量分别为30 μl时;平板离心机转速为1000 r/min,时间为1 min,振荡悬浮速度为1000 r/min,振幅3。通过全自动酶标仪判读与目测判读一致,经统计学处理。结论 取样量分别为30 μl时自动化微板法的操作简单,自动化高,省工省时,检测结果利于保存。
【关键词】STAR加样仪器;RHD血型;微板;试验条件
为了筛查RHD血型阴性的献血员,我站在全市献血者中普查RHD血型,为了提高检测效率,方法学从手工向自动化操作转变。因最初的使用酶标仪判读准确率低,究其原因,与实验的条件中液体量的选择有关,通过对RHD血型检测微板试验条件中液体量的选择,使方法步骤得以完善,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 STAR全自动加样机(瑞士 TECAN公司);Labbofuge400平板离心机(美国 BECKMAN公司),TS孵育振荡器(奥地利 Anthos公司);96孔U型板;RHD单克隆抗体(长春生物制品研究所);酶标仪(瑞士 TECAN公司)。
1.2 试验步骤
1.2.1 使用STAR全自动加样机将不同液体量的抗体与2%的RHD阴性标本红细胞等量混于U型板孔内,取样量分别是为20、30、50 μl。每一取样量做20份试验。
1.2.2 混合后立即用平板离心机离心,1000 r/min,1 min,然后用振荡仪振荡1000 r/min,振幅3,1 min
1.2.3 酶标仪判读 620 nm 读板,记录每一孔OD值,临界值设定为0.6,大于0.6为 有凝集现象,判定为阳性,小于0.6无凝集现象,判定为阴性。
1.2.4 经统计学处理 取样量20、30、50 μl时OD值的变异系数分别为0.342、0.135、0.473,三者存在明显差异。取样量30 μl时的变异系数最小。
2 结果
2.1 用STAR全自动加样机分别将抗血清和2%的红细胞各30 μl混与96孔微孔板内,经1000 r/min、1 min离心,1000 r/min、振幅3、1 min振荡,酶标仪620 nm 3 min之内判读结果。
2.2 应用效果,用上述方法对30 342份标本进行筛查,其中RHD阴性标本为15份,阳性性标本30 327份,无一例判读错误发生。
3 讨论
微板法血型的检测,因其酶标仪判读易出现不准确的问题,一直是筛查RHD阴性献血员不能全自动处理的障碍,620 nm可见光的判读,关键点在于光的通透程度,阳性红细胞聚集于与孔底,OD值会很高,阴性红细胞经振荡后完全散开悬浮起来,OD值会很低,由于加液体积的不同,红细胞真实量的不同,会导致未凝集红细胞悬浮程度有很大的差异,而导致OD值的变化,相对稳定的OD值范围会提高判读的可信程度,多次检测后数据的变异系数提供了方法学的理论基础。
在判读的过程中,因红细胞仅仅做了稀释,为了防止微量的补体参与而引起的溶血过程,在加样结束后,需要尽快的离心振荡。在振荡结束后,为了防止静置时间过长导致的悬浮红细胞沉积,引起OD值增高的判读错误,所以在振荡后3 min之内应完成判读。
参考文献
[1] 李勇,杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.中国科学技术出版社,1999:125 163., http://www.100md.com(陈淑娇)
【关键词】STAR加样仪器;RHD血型;微板;试验条件
为了筛查RHD血型阴性的献血员,我站在全市献血者中普查RHD血型,为了提高检测效率,方法学从手工向自动化操作转变。因最初的使用酶标仪判读准确率低,究其原因,与实验的条件中液体量的选择有关,通过对RHD血型检测微板试验条件中液体量的选择,使方法步骤得以完善,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 STAR全自动加样机(瑞士 TECAN公司);Labbofuge400平板离心机(美国 BECKMAN公司),TS孵育振荡器(奥地利 Anthos公司);96孔U型板;RHD单克隆抗体(长春生物制品研究所);酶标仪(瑞士 TECAN公司)。
1.2 试验步骤
1.2.1 使用STAR全自动加样机将不同液体量的抗体与2%的RHD阴性标本红细胞等量混于U型板孔内,取样量分别是为20、30、50 μl。每一取样量做20份试验。
1.2.2 混合后立即用平板离心机离心,1000 r/min,1 min,然后用振荡仪振荡1000 r/min,振幅3,1 min
1.2.3 酶标仪判读 620 nm 读板,记录每一孔OD值,临界值设定为0.6,大于0.6为 有凝集现象,判定为阳性,小于0.6无凝集现象,判定为阴性。
1.2.4 经统计学处理 取样量20、30、50 μl时OD值的变异系数分别为0.342、0.135、0.473,三者存在明显差异。取样量30 μl时的变异系数最小。
2 结果
2.1 用STAR全自动加样机分别将抗血清和2%的红细胞各30 μl混与96孔微孔板内,经1000 r/min、1 min离心,1000 r/min、振幅3、1 min振荡,酶标仪620 nm 3 min之内判读结果。
2.2 应用效果,用上述方法对30 342份标本进行筛查,其中RHD阴性标本为15份,阳性性标本30 327份,无一例判读错误发生。
3 讨论
微板法血型的检测,因其酶标仪判读易出现不准确的问题,一直是筛查RHD阴性献血员不能全自动处理的障碍,620 nm可见光的判读,关键点在于光的通透程度,阳性红细胞聚集于与孔底,OD值会很高,阴性红细胞经振荡后完全散开悬浮起来,OD值会很低,由于加液体积的不同,红细胞真实量的不同,会导致未凝集红细胞悬浮程度有很大的差异,而导致OD值的变化,相对稳定的OD值范围会提高判读的可信程度,多次检测后数据的变异系数提供了方法学的理论基础。
在判读的过程中,因红细胞仅仅做了稀释,为了防止微量的补体参与而引起的溶血过程,在加样结束后,需要尽快的离心振荡。在振荡结束后,为了防止静置时间过长导致的悬浮红细胞沉积,引起OD值增高的判读错误,所以在振荡后3 min之内应完成判读。
参考文献
[1] 李勇,杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.中国科学技术出版社,1999:125 163., http://www.100md.com(陈淑娇)