多西苯醌联合塞来昔布对结肠癌细胞抑制作用的研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(2276KB，3页)。
1.2.4 免疫荧光染色方法观察VEGF蛋白表达情况 具体实验方法为:取生长对数期细胞,经胰酶消化制成单细胞悬液后,细胞爬片;待细胞生长稳定后,按上述实验分组药物作用48 h后PBS充分漂洗,分别通过4%多聚甲醛固定、0.2%Triton细胞穿孔、1%BSA封闭;然后避光加入1%BSA稀释的一抗4 ℃孵育过夜; PBS漂洗后避光加入1%BSA稀释的二抗于37 ℃杂交1 h;最后用PBS洗掉杂质,封片,在激光共聚焦显微镜下观察、拍照,利用Image Pro Plus6.0软件分析细胞内荧光强度,以细胞内的平均荧光强度反映细胞内VEGF的表达量。
1.2.6 统计学分析 所得实验数据以(x±s)表示,采用SPSS13.0for windows软件包进行分析。
2 结果
2.1 药物处理后结肠癌HT 29细胞形态学变化 倒置相差显微镜观察到对照组正常生长的结肠癌HT 29细胞,呈类圆形,少数呈梭形,且细胞折光性好,以贴壁方式生长,经过药物作用24 h后,50 μmol/L AA 861与50 μmol/L塞来昔布组细胞分别表现出现细胞变圆变小,细胞内颗粒状物质增多,折光性降低,这种变化随着时间及药物浓度的加大,更加明显,尤其AA 861与塞来昔布联合作用72 h后,细胞生长状态最差,部分细胞呈悬浮状态生长(图1)。
2.2 AA 861与塞来昔布单独及联合应用对HT 29细胞增殖的抑制 AA 861与塞来昔布单独及联合作用于HT 29细胞后,都以时间浓度依赖性抑制细胞增殖,其中AA 861 100 μmol/L(43.2%),塞来昔布100 μmol/L(42.8%),100 μmol/Lmol/LAA 861+100 μmol/L塞来昔布组(53.8%),两种药物联合应用组抑制率分别高于单独应用AA 861(P<0.001)或塞来昔布(P<0.001)(表1)。
表1
AA 861与塞来昔布单独及联合应用48 h后
HT 29细胞的吸光度(x±s)
药物组吸光度
对照组0.528+0.005
AA 861 100 μmol/L0.300+0.003*#
塞来昔布100 μmol/L0.302+0.002*#
AA 861 100 μmol/L+塞来昔布100 μmol/L0.244+0.005*
注:*P<0.001VS对照组,#P<0.001VS两药联用组
2.3 激光共聚焦显微镜检测细胞内VEGF表达 以细胞内平均荧光强度表示细胞内的VEGF表达情况,免疫荧光照片显示,各实验组细胞免疫荧光强度随着药物浓度的加大逐渐减弱,而两种药物联合应用组荧光强度最弱(图2)。经图像分析软件分析后,各实验组与对照组细胞的荧光强度有统计学意义(表2)。
表2
AA 861与塞来昔布单独及联合应用48 h后
HT 29细胞VEGF表达的影响(x±s)
分组细胞平均荧光强度
对照组0.046+0.002
AA 861 100 μmol/L0.025+0.001*#
塞来昔布100 μmol/L0.027+0.002*#
AA 861 100 μmol/L+塞来昔布100 μmol/L0.017+0.002*
注:*P<0.001VS对照组,#P<0.001VS两药联用组
图1 AA 861与塞来昔布单独及联合应用48 h后HT 29细胞形态学变化(10×)
A:对照组;B:塞来昔布100 μmol/L;C:AA 861 100 mol/L;D:100 μmol/L AA86 1+100 μmol/L塞来昔布
图2 AA 861与塞来昔布单独及联合应用48 h后HT 29细胞内VEGF表达情况
A:对照组;B:塞来昔布100 μmol/L;C:AA 861 100 mol/L;D:100 μmol/L AA86+100 μmol/L塞来昔布
3 讨论
花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是人体必需的一种不饱和脂肪酸,广泛存在于哺乳动物的中性脂肪中,参与组成细胞膜磷脂,在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下可分解生成游离的花生四烯酸。AA代谢主要有环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两条代谢通路,COX 2及5 LOX分别通过各自的代谢产物前列腺素
(PGs)和白三烯(LTs)等参与肿瘤的发生发展过程[1 2]。随着研究的深入,发现AA的代谢通路COX 2及5 LOX之间存在交叉平衡关系,Goulet JL等[3]的实验发现,敲除5 LOX、COX 1、COX 2等基因可以引其他花生四烯酸代谢途径的活化,并且,应用其中一条通路的化学抑制剂后也可以活化另外的代谢途径[4]。Fabio Cianchi[5]等的实验发现,结肠癌的Caco 2和HT 29细胞都有COX 2和 5 LOX的高表达,并且两种细胞应用COX 2抑制剂塞莱昔布后都出现了COX 2代谢产物PGE2的降低,然而也都出现了5 LOX代谢产物CysLT的升高。而联合应用塞莱昔布和MK886后,则可以抑制塞莱昔布引起的CysLT上升和MK886引起的PGE2上升,并且对肿瘤的抑制效果优于只用一种同浓度抑制剂的实验组。本实验中采用5 LOX抑制剂(AA 861)和COX 2抑制剂(塞来昔布)分别单独及联合应用,通过相差显微镜观察到,两种药物都能使体外培养的结肠癌HT 29细胞的形态发生明显变化,而两种药物联合应用组,细胞形态变化最明显,细胞增殖受到明显抑制。MTT结果提示AA 861与塞来昔布都以时间浓度依赖性抑制结肠癌细胞增殖,且两种药物联合应用组抑制率最高。这可能是因为同时抑制花生四烯酸的两条代谢通路后,阻止了一条代谢通路向另一条代谢通路的分流作用,从而产生更强的抗肿瘤作用。
血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的过度表达与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切,以VEGF及其受体作为相对特异的肿瘤血管生成标记物,抑制其表达或阻断其效应是目前国内外抗血管生成治疗肿瘤的热点 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2276KB，3页)。